W celu szybkiej diagnostyki zarówno chorób genetycznych jak i wirusowych, czy bakteryjnych, opracowuje się coraz to nowsze metody diagnostyczne. Większość z nich oparta jest na rutynowej izolacji materiału genetycznego (z różnych materiałów biologicznych), a następnie na jego amplifikacji za pośrednictwem reakcji PCR. W związku z tym ciągle dąży się do opracowania szybkich i skutecznych metod izolacji DNA, by redukować koszty diagnostyki molekularnej, a także przyśpieszać otrzymywanie wyników.

Słowa kluczowe:  krew obwodowa, żywica Chelex-100, filtry papierowe, Koi Herpesvirus (KHV), jądrzaste erytrocyty, PCR, wysokocząsteczkowy i niskocząsteczkowy DNA, archiwizowane tkanki, genomowe DNA.


Izolacja DNA z krwi obwodowej jest początkowym etapem w badaniach klinicznych ( np. do identyfikacji mutacji DNA), w których przeprowadza się reakcje PCR. Tradycyjne procedury izolacji zapewniają obfite ilości wysoko oczyszczonego DNA ,które w zasadzie przekraczają ( zarówno w ilości jak i jakości) standardy wymagane do pomyślnego przeprowadzenia reakcji PCR , ponadto są to procedury stosunkowo drogie, powolne i pracochłonne, a dodatkowo zawierają wiele transferów i narażenia na toksyczne substancje chemiczne  [6].
Aby przezwyciężyć te problemy opracowano alternatywne metody ekstrakcji, które są ulepszone i uproszczone pod względem przetwarzania danej próbki. Ponadto, dostępne są także komercyjne produkty, w których wyeliminowano wykorzystanie toksycznych substancji i skrócono czas przetwarzania danych (na przykład, zestaw krwi QIAamp, Qiagen Inc, Chatsworth, Kalifornia, USA) [6].
Celem badania J.M. Polski i wsp.(1998),  było określenie, czy Chelex100 może być używana do krwi obwodowej  impregnowanej na filtrach papierowych (szybkie przetwarzanie) w celu opracowania efektywnej procedury odzyskiwania DNA opartej na technice PCR , w celu wykorzystania DNA do  badań diagnostycznych- badania schorzeń dziedzicznych  [6].

Chelex-100 jest żywicą chelatującą o wysokim powinowactwie do jonów metali wielowartościowych. Wiążąc i usuwając jony podczas izolacji DNA (po podgrzaniu) zapobiega uszkodzeniom DNA i redukuje inhibitory polimerazy TaqDNA. Razem te dwa czynniki pozwalają na efektywne wykorzystanie minimalnie przetworzonych próbek krwi w reakcji PCR. Procedura izolacji DNA oparta na wykorzystaniu żywicy Chelex-100 jest uniwersalna, nie wymaga przygotowania warstwy buforu  i można w niej wykorzystywać zaschniętą krew jako źródło DNA  [6].
Chelex-100  używa się do odzyskiwania DNA z różnych próbek biologicznych , w tym z: próbek do medycyny sądowej, zaparafinowanych tkanek stałych, pełnej krwi myszy, suszonych plam krwi na filtrach papierowych (dla testów wirusologicznych), kultur lub próbek klinicznych (do badań mikrobiologicznych) [6].
W doświadczeniu przeprowadzonym przez J.M. Polski i wsp (1998), próbki krwi obwodowej (5 ml każda) wykorzystano do przygotowania buforu (wg instrukcji)  i rutynowych izolacji DNA za pomocą Qiagen QIAamp blood kit (kontrola DNA), zgodnie z zaleceniami w instrukcji producenta. Krótko mówiąc,  200μl buforu inkubowano z proteinazą K, zmieszano z etanolem i zwirowano na kolumnie (QIAamp spin kolumn). Po wirowaniu kolumnę przemyto, DNA eluowano rozgrzanym buforem  [6].


Szybka metoda ekstrakcji genomowego DNA (Polski J.M i wsp. 1998) [6].

Dysk papierowego filtru (bibuła filtracyjna, 7mm, Whatman 3M), podziurkowano bezpośrednio w 500μl sterylnych probówkach używając sterylnego dziurkacza. 10 μl krwi obwodowej nakropiono na papierowy filtr w probówce wirówkowej . Po 30 minutach suszenia w temperaturze pokojowej, na filtr dodano 500 μl sterylnej wody (millipore) , a następnie próbkę wirowano w temperaturze pokojowej     przez     10     minut   [6].
 Po całkowitym usunięciu supernatantu (niezbędnego dla pewnej amplifikacji), dodano 200 μl 5% żywicy Chelex-100 (Bio Rad Laboratories, Hercules, California, USA). Próbkę inkubowano w termocyklerze (Barnstead Thermolyne, Dubuque, Iowa, USA) przez 90 minut w 56˚C , a następnie przez 10 minut w temperaturze 99˚C.  Po ochłodzeniu próbkę krótko  vorteksowano i zwirowano . Otrzymany supernatant był używany  jako substrat w reakcji PCR  [6].
Wyniki przeprowadzonego  badania(Polsk J.M. i i wsp., 1998)  wskazują, że odzyskanie DNA z bibuły filtracyjnej nasyconej pełną krwią jest użyteczną metodą przygotowania DNA do PCR (w celu wykorzystania do testów genetycznych). Metoda ta jest opłacalna, efektywna , nietoksyczna i łatwa w stosowaniu, a większość czynności można wykonać w termocyklerze.  Ponadto cała procedura odbywa się w jednym pojemniku, zmniejszając szanse na zanieczyszczenie próbki, straty próbki lub błędy. DNA z krwi na filtrze z papieru impregnowanego pozostaje stosunkowo stabilne w temperaturze pokojowej przez co najmniej 4.5 miesiąca  [6].
Polski J.M i wsp. (1998) na podstawie przeprowadzonego doświadczenia , stwierdzili, że metoda z wykorzystaniem Chelex-100 i filtru papierowego może być metodą alternatywną w warunkach klinicznych do izolacji DNA. Jest metodą łatwą, stabilna i niedrogą, zapewniającą stabilny DNA dla wielu testów. Możliwość zanieczyszczenia próbki jest ograniczona, , ponadto metoda pozwala na łatwe przechowywanie transport próbek od momentu rejestracji  [6].
 W wyniku reakcji PCR ( Polski J.M i wsp, 1998), uzyskano identyczne wyniki z DNA izolowanego rutynowymi metodami jak i z wykorzystaniem filtru papierowego i Chelex-100  [6].

Izolowanie DNA z jądrzastych erytrocytów [1], [7].

Koi Herpesvirus (KHV) jest wysoce zaraźliwą chorobą wirusową, która powoduje znaczne zachorowalności i śmiertelności w karpia (Cyprinus carpio) i jej ozdobnej formy udomowionej, karp koi. Choć wirus jest obecnie uważany za DNA wirusów należących do rodziny Herpesviridae, niektóre raporty mają wątpliwości tej klasyfikacji i zmieniono nazwę wirusa jako Carp Nephritis i Gill Necrosis Virus, CNGV. Niedawno, raporty na podstawie morfologii i genetyki wykazały mocne dowody, że KHV jest rzeczywiście herpeswirusem [7].

Koi Herpesvirus (KHV) dotyczy zarówno młodych jak  i dorosłych karpi i koi, i jest szczególnie zabójczy dla narybku. Wysoka śmiertelność spowodowana przez chorobę wywarła negatywny wpływ na handel międzynarodowy . Do wykrywania KHV stosowane są różne techniki diagnostyczne, w tym: izolacja wirusa w hodowli komórkowej, mikroskopia elektronowa, kilka testów PCR, ELISA,  hybrydyzacji in situ. Wszystkie te metody są czasochłonne, pracochłonne i wymagają specjalistycznego sprzętu [7].

W celu szybkiej diagnostyki zakażenia wirusem KHV stosuje się coraz to nowsze metody identyfikacji, oparte zazwyczaj na izolacji kwasów nukleinowych z komórek ryb ( głównie z jądrzastych erytrocytów),     a     następnie     na     ich     amplifikacji     (PCR).                                                                                      Aktualnie, jedną z najnowszych metod jest tzw. reakcja LAMP (amplifikacji kwasu nukleinowego za pośrednictwem izotermicznej amplifikacja, oparta na przesunięciu syntezy  nici DNA przez polimerazę Bst DNA). W reakcji tej wykorzystuje się specjalnie zaprojektowane dwa wewnętrzne i dwa zewnętrzne startery, w celu poprawy specyficzności [7].

U kręgowców takich jak: ryby, płazy, gady i ptaki występują jądrzaste erytrocyty (Andrew 1965). U ryb występuje średnio od 500 000 – 2 600 000 erytrocytów w 1 mm3. Z kolei , erytrocyty pstrąga zawierają ok. 5,6 pg DNA na jądro (Mirsky i Ris 1949). W związku z tym, możliwe jest uzyskanie (wyizolowanie)stosunkowo dużej ilości DNA z niewielkiej ilości krwi [1], [5].
Opisana metoda opiera się na odbiałczaniu do którego używa się roztworu NaCl, powodującego odwodnienie i wytrącenie białek zawartych w komórkach krwi. Materiałem w przedstawionej metodzie jest krew ryby np. krew z żyły ogonowej pstrąga lub karpia [1], [5].
Krew , z której będzie izolować się DNA należy pobrać na antykoagulant (np. EDTA) do probówki o pojemności 5 ml (probówka musi znajdować się w lodzie). Następnie krew należy odwirować (1300 x g, temp. 4˚C, 30 min). Po wirowaniu, erytrocyty tworzące osad (ok. 10-100μl) zawiesić w 3 ml buforu do lizy (tj. 10 mM Tris, 400 mM NaCl, 2 mM EDTA(pH=8.2)) w probówce o poj. 15 ml. Do probówki dodać 0,2 ml SDS (1% roztwór SDS w 2 mM EDTA o pH=8.2) oraz 0,5 ml proteinazy K (stężenie 2 mg/ml) [1], [5].
Całość inkubować w 50˚C przez 2 h, od czasu do czasu łagodnie wytrząsając w celu strawienia białek jądrowych i komórkowych.  Strawione białka wytrącić przez dodanie 1 ml 6 M roztworu NaCl, energicznie wytrząsając przez 15 sekund. Po wytrząsani próbkę odwirować (1300 x g, 4˚C, 15 min). Otrzymany w wyniku wirowania supernatant przenieść do nowej probówki. Następnie przeprowadzić 2-krotne wysalanie białek (tj. dodać 1 ml 6M roztworu NaCl, wytrząsać energicznie przez 15 sekund, odwirować, a otrzymany supernatant przenieść do nowej probówki). Po ostatniej ekstrakcji powinno się otrzymać całkowicie przejrzysty supernatant [1], [5].
Otrzymany supernatant wytrącać 2 objętościami etanolu (96% roztwór etanolu) o temperaturze pokojowej. DNA odzyskać przez nawinięcie na bagietkę.  Otrzymane DNA płukać 2-krotnie 70% roztworem etanolu, a dalej wysuszyć je na powietrzu. Wysuszone DNA rozpuścić w 200 μl buforu TE o pH=7.6 (tj. 10 mM Tris/HCl, 0,2 mM EDTA).
Wydajność przedstawionej metody wynosi 220 μg DNA ze 100 μl upakowanych(pod wpływem wirowania) erytrocytów pstrąga lub karpia. Otrzymany DNA nadaje się jako substrat do reakcji PCR.
Należy pamiętać, że w przypadku gdy objętość upakowanych erytrocytów przekracza 200 μl, to powinno się wydłużyć czas trawienia proteinazą K nawet do co najmniej 8 godzin.
DNA zabezpieczone buforem TE można poddać inkubacji w 95˚C w celu usunięcia DNaz [1], [5].

Izolowanie DNA z archiwizowanych tkanek w celu zastosowania w reakcji PCR [2], [5].

Dzięki poznaniu metody archiwizowania tkanek w parafinie możliwe jest badanie tych próbek na poziomie molekularnym nawet po upływie wielu lat. Pozwala to tym samym na działania o charakterze retrospektywnym, które mogą dotyczyć dużej liczby osobników, a dodatkowo możliwe jest śledzenie w dużych przedziałach czasowych zmian genetycznych, bądź też czynników infekcyjnych, które to związane są z rozmaitymi chorobami [2].
Analiza na poziomie klinicznym  istotnych zmian DNA tkanek, które archiwizowane były przez długi czas w parafinie w ogromnej mierze zależy od umiejętności prawidłowego i zarazem efektywnego izolowania materiału genetycznego (DNA) [2], [5].  
W przedstawionej metodzie izolacji DNA jako materiału używa się tkanek archiwizowanych w postaci bloków parafinowych [2], [5].
Pierwszym krokiem w izolacji jest sporządzenie z bloków parafinowych skrawków o grubości ok. 5-10 μm. W tym celu bardzo użyteczny staje się mikrotom, pozwalający na precyzyjne cięcie takich skrawków. Pocięte skrawki należy umieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml (jeden skrawek w jednej probówce). Do każdej probówki należy dodać 1 ml ksylenu, a następnie mieszać przez 30 min. Próbki odwirować (14 000 x g, temp. pokojowa, 5 min). Po wirowaniu usunąć supernatant (etap z dodawaniem ksylenu, mieszaniem i wirowaniem ponownie powtórzyć) [2].
Po wirowaniu do probówki dodać 0,5 ml absolutnego etanolu, a całość wymieszać przez delikatne odwracanie probówki.  Odwirować ( 14 000 x g, temp. pokojowa, 5 min), po wirowaniu usunąć starannie jak największą ilość etanolu. Znów dodać etanol (jak wcześniej), wymieszać odwirować (14 000 x g, temp. pokojowa, 5 min) i usunąć etanol. Probówkę wysuszyć w aparacie próżniowym w celu całkowitego odparowania etanolu [2], [5].
Następnie do probówki dodać 100 μl buforu do trawienia zawierającego proteinazę K (tj. 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris/HCl, 0,5% Tween 20 o pH=9.0, proteinaza K w stężeniu 200 μg/ml)- w przypadku dużych próbek ilość dodawanego buforu do trawienia można zwiększyć do 200μl. Próbkę z buforem inkubować w temp. 55˚C przez 3 godziny. Po inkubacji krótko odwirować dla usunięcia cieczy z górnej części probówki. Znów inkubować w temp. 95˚C przez 8-10 minut, w celu inaktywacji proteinazy K.  Nie należy przekraczać 10 minut inkubacji inaktywując proteinazę K. Otrzymany preparat DNA przechowywać w temperaturze -20˚C [2], [5].

Metody izolacji wysokocząsteczkowego i niskocząsteczkowego DNA
Izolowanie wysokocząsteczkowego DNA z krwi [3], [5].  
Z przeprowadzonych badań wynika, że konwencjonalne metody nie nadają się do izolacji wysokocząsteczkowego DNA , ze względu na jego dużą podatność na uszkodzenia. Zwiększona wrażliwość wysokocząsteczkowego DNA spowodowana jest konsekwencją dużej wartości stosunku długości  do średnicy heliksu wysokocząsteczkowego DNA [3], [5].
W trakcie izolacji wysokocząsteczkowego DNA wykorzystuje się działanie destabilizujące i denaturujące izotiocyjanian guanidyny, który działa na makrocząsteczki- w tym też na enzymy trawiące DNA. Rozpuszczone w roztworze izotiocyjanian guanidyny DNA, można wytrącić stosując w tym celu standardowo alkohol izobutylowy. Przedstawiona poniżej metoda oprócz zastosowania do izolacji genomowego DNA , może być także używana do oczyszczania plazmidów i kosmitów. Jedną z głównych zalet tej metody jest krótki czas jej wykonywania [3], [5].
Krew, z której ma być izolowane wysokocząsteczkowe DNA zmieszać z 5 objętościami buforu do lizy erytrocytów (tj. 140 mM NH4Cl, 100 mM Tris/HCl o pH=7.6) ogrzanego do temperatury 37˚C. Po dodaniu buforu próbkę inkubować w 37˚C przez 5 minut. Następnie odwirować (1000 x g, temp. 25˚C, 10 min). Otrzymany po wirowaniu supernatant ostrożnie usunąć. Powstały osad leukocytów zawiesić w 10 ml 0,85% roztworu NaCl. Znów wirować (jak wyżej), otrzymany osad leukocytów zawiesić w 10 ml 0,85% roztworu NaCl (schemat ten powtarzać aż do momentu uzyskania zadowalającego niskiego poziomu zanieczyszczenia erytrocytami) [3], [5].
Po ostatnim wirowaniu, osad leukocytów zawiesić w buforze HTE (bufor HTE o pH=8.0 tj. 100 mM Tris/HCl, 40 mM Na2EDTA). Po dodaniu buforu HTE, należy przeprowadzić  lizę leukocytów, wykonując szybką iniekcję (strzykawką z igłą nr 18) 2 ml roztworu SDS (tj. 0,2% roztwór SDS w buforze HTE ) do zawiesiny leukocytów. Do tak zlizowanych komórek dodać 1,5 objętości roztworu izotiocyjanian guanidyny (tj. 6 M roztwór izotiocyjanian guanidyny), całość próbki wymieszać przez odwracanie probówki. Po tym etapie przeprowadzić ekstrakcję białek komórkowych za pomocą równej objętości mieszaniny fenol/chloroform/alkohol izoamylowy ( 25:24:1).
Ekstrakcję powtarzać do momentu zaniku interfazy (zazwyczaj do całkowitego zaniku interfazy wystarczy powtórzenie 2-3 ekstrakcji) [3], [5].
Do fazy wodnej zachowanej po ostatniej ekstrakcji, dodać równą objętość alkoholu izobutylowego , w celu wytrącenia DNA. Wielkocząsteczkowy DNA odzyskać używając w tym celu pipety ze ściętym końcem. DNA płukać w 70% roztworze etanolu (bez wirowania).  Tak wyizolowane DNA rozpuścić w buforze TE (tj. 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH=8.0) w temperaturze 4˚C, przez co najmniej 24h [3], [5].   
Izolując tą metodą otrzymujemy DNA, które jest stabilne w roztworze izotiocyjanian guanidyny przez co najmniej 2 miesiące. Wydajność przedstawionej metody przekracza niemal 2-krotnie wydajność tradycyjnie stosowanej metody fenolowej [3], [5].

Izolowanie niskocząsteczkowego DNA [4], [5].
W trakcie enzymatycznego trawienia jąder komórkowych może dochodzić do sytuacji, w której w chromatynie będą występować krótkie, powtarzające się fragmenty DNA. Ich masa cząsteczkowa może wahać się w granicach 45 000 – 65 000. Podobnie  in vivo, w wątrobie lub w trzustce, mogą formować się fragmenty tej samej długości, w związku z czym wysokocząsteczkowe DNA może być także izolowane z tych narządów [4],     [5].                                                                                                          Przedstawiona poniżej metoda izolacji niskocząsteczkowego DNA opiera się na izolowaniu jąder komórkowych, a następnie ekstrakcji DNA za pomocą rozpuszczalników organicznych [4], [5].
W przypadku izolacji DNA ze świeżo pobranej wątroby szczura, należy ją najpierw wypłukać w zimnym roztworze 0,25 M sacharozy, a dalej homogenizować w homogenizatorze nożowym w chłodni. Następnie, rozdrobnioną w ten sposób wątrobę należy homogenizować w buforze do homogenizacji (tj. 2,2 M sacharoza, 3 mM CaCl2), w temp. 4˚C, używając w tym celu 12 części buforu na 1 część zmielonej tkanki.  Otrzymany homogenat odwirować (40 000 x g, 4˚C, 1 godzina). Otrzymany po wirowaniu osad jąder, zawiesić w roztworze o składzie 1 M sacharoza, 1 mM CaCl2. Próbkę zwirować (1000 x g, temp. 4˚C, 10 minut). Zebrać osad oczyszczonych jąder komórkowych i zawiesić je w buforze do lizy (tj. 1% SDS, 1 mM EDTA), używając 1-2 ml buforu na ilość jąder otrzymaną z 1 g tkanki [4], [5].
Następnie dodać RNazę (RNaza o stężeniu 10 mg/ml w 0,15 M roztworze NaCl , pH=5.0) do końcowego stężenia 200μg/ml, poddając ją wstępnej inkubacji (w temperaturze 90˚C przez 10 min),a dalej inkubować w temperaturze 37˚C przez 1 godzinę. Po inkubacji do próbki dodać pronazę (pronaza o stężeniu 20 mg/ml) do końcowego stężenia 300 μg/ml i inkubować w 37˚C przez 2 godziny. Próbkę odwirować (10 000 x g, 4˚C, 30 minut). Otrzymany po wirowaniu supernatant zachować! [4], [5].
Do supernatantu dodać 4 M roztwór NaClO4 w takiej ilości, aby końcowe stężenie wynosiło 1 M. Ekstrahować  próbkę 4 razy mieszaniną alkohol izoamylowy/chloroform (objętość 1:5), wirując po każdej ekstrakcji (10 000 x g, 4˚C, 30 minut) [4], [5].
Otrzymane DNA wytrącić za pomocą 2 objętości zimnego etanolu, a dalej odzyskać je przez wirowanie (27 000 x g, temp. 4˚C, 30 minut). DNA rozpuścić w buforze TE o pH=7.6 (tj. 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA) [4], [5].
Wydajność przedstawionej metody izolacji wynosi ok. 95% [4], [5].








Literatura:
[1]. Medrano J.F., Aasen E., Sharrow L, 1990. DNA extraction from nucleated red blood cells. Biotechniques, 8:43
[2]. Sepp R.,Szabo I., Uda H., Sakamoto H, 1994. Rapid techniques for DNA extraction from routinely processed archival tissue for use in PCR. J.Clin. Pathol., 47:318-323.
[3]. Nelson J.E., Krawetz S.A, 1992. Purification of cloned and genomic DNA by guanidine thiocyanate/izobutyl alkohol fractionation. Anal. Biochem., 207:197-201.
[4]. Rossi R., Viola-Magni M.P., 1978. Proc. Exp. Biol. Med., 158:117-122.
[5]. Kłyszejko-Stefanowicz L, 2003. Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003, s. 366-381
 [6]. Polski J.M., Kimzey S, Percival R. W., Grosso L.E., 1998. Rapid and effective processing of blood specimens for diagnostic PCR using filter paper and Chelex-100. J Clin Pathol: Mol Pathol 1998;51:215–217.
[7]. Soliman H., El-Matbouli M., 2005. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification, 2005. Virology Journal 2005, 2:83

Drukuj PDF