Akceptuję
W ramach naszej witryny stosujemy pliki cookies w celu świadczenia państwu usług na najwyższym poziomie, w tym w sposób dostosowany do indywidualnych potrzeb. Korzystanie z witryny bez zmiany ustawień dotyczących cookies oznacza, że będą one zamieszczone w Państwa urządzeniu końcowym. Możecie Państwo dokonać w każdym czasie zmiany ustawień dotyczących cookies. Więcej szczegółów w naszej Polityce Prywatności

Zamknij X
Strona główna Artykuły

Fibrynogen i trombina jako elementy procesu krzepnięcia krwi

Izolowanie fibrynogenu (metoda Blombäck’a, 1956)

Metoda polega na wytrąceniu z osocza tzw. I frakcji Cohna, którą oczyszcza się za pomocą mieszaniny cytrynianowo-etanolowo-gicynowej. Mieszanina ta ma dobrane stężenia w ten sposób, by sprzyjały one rozpuszczaniu się wszystkich składników białkowych poza fibrynogenem [8].

 

Wykonanie:

Jako materiał do oznaczenia wykorzystuje się osocze, zawieszone w roztworze cytrynianu sodu, które należy doprowadzić do pH=7,2 (za pomocą buforu octanowego). Próbkę oziębić w łaźni z lodem do temp. 0°C, a dalej dodać do niej kroplami (stale mieszając) wychłodzony etanol do końcowego stężenia równego 8% (tj.: 177 ml 53,3 % etanolu na 1000 ml osocza). W trakcie dodawania etanolu należy stopniowo obniżyć temperaturę do -3°C,po czym próbkę osocza pozostawić w tej na 30-60 minut (ciągle delikatnie mieszając).

Frakcję I Cohna (strąt) należy oddzielić przez wirowanie przy 2500 obr./min w temp. -3°C przez 20 minut (z 1 litra osocza uzyskuje się 30-40 g osadu). Otrzymana frakcja zawiera ok. 40-50% białka wykrzepianego trombiną. W kolejnym etapie oczyszczania, do próbki dodaje się  bufor cytrynianowy z etanolem i glicyną (podwójne ekstrahowanie próbki).

 

Ekstrakcja I: do otrzymanego osadu należy dodać 700 ml zimnego odczynnika tj. 0,055 M bufor cytrynianowy- 6,5% etanol- 1 M glicyna o pH=6,0 (tj.: 16,177 g C6H5O7Na3∙2H2O i 75 g glicyny rozpuścić w 800 ml wody, dodać 65 ml absolutnego etanolu, po czym roztwór doprowadzić do pH=6,0 za pomocą stężonego roztworu HCl. Całość uzupełnić wodą do obj. 1000 ml). Otrzymaną zawiesinę należy mieszać przez 1 godzinę (w temp. -3°), a następnie odwirować przy 2500 obr./min, w temp. -3°C przez 20 minut. Supernatant otrzymany po wirowaniu należy usunąć.

 

Ekstrakcja II: Proces ekstrakcji jest identyczny jak wyżej. Do osadu dodać 700 ml zimnego  odczynnika tj. 0,055 M bufor cytrynianowy- 6,5% etanol- 1 M glicyna (o pH=7,2). Osad należy rozpuścić w 60 ml 0,055 M roztworu cytrynianu sodowego, po czym mieszaninę dializować przez co najmniej 12 godzin (wobec cytrynianu sodowego). Otrzymane nierozpuszczalne części usunąć przez wirowanie (4000 obr./min przez 20 minut). Stężenie otrzymanego fibrynogenu oznaczyć spektrofotometrycznie [8].


Metoda von Claussa (oznaczanie czasu krzepnięcia trombiny) [9].

 

Zasada metody: trombina obecna w nadmiarze powoduje, że czas krzepnięcia rozcieńczonego osocza jest odwrotnie proporcjonalny do stężenia fibrynogenu osocza. Do oznaczenia przygotowuje się krzywą kalibracyjną, gdzie na osi odciętych zaznacza się wartości otrzymanych rozcieńczeń, a na osi rzędnych odpowiednie czasy krzepnięcia. Na rynku dostępne są gotowe, proste w użyciu zestawy odczynników służące do oznaczania czasu krzepnięcia trombiny, opierające się na powyższej metodzie [9].

 

Odczynniki:

1) Trombina: liofilizat, w odczynniku obecna jest niewielka ilość kaolinu, dzięki któremu łatwiejsze jest wykrycie krzepnięcia (poprawa właściwości optycznych)

2) Bufor: w skład buforu wchodzi cytrynian, pełniący funkcję antykoagulanta oraz inhibitory fibrynolizy (wykorzystywane do oznaczania krwi włośniczkowej)

Jako materiał badany w metodzie wykorzystywana jest krew żylna, pobierana do probówek zawierających wysuszony odczynnik Wintrobe’a lub płynny roztwór cytrynianu (1 ml cytrynianu trójsodowego 3,8% do 9 ml krwi). Pobraną krew żylną należy wirować przy 2 000 x g/min. przez 10 minut [9].

 

Wykonanie oznaczenia:

A) Liofilizat: do fiolki (probówki) zawierającej liofilizat należy dodać 2 ml wody dejonizowanej, fiolkę zamknąć, a zawartość rozpuszczać przez delikatnie mieszanie (przez 10 minut). Po wymieszaniu, inkubować fiolkę przez 15 minut, po czym ponownie wymieszać (należy unikać powstawania piany w próbce).

B) Osocze: badane osocze z buforem należy rozcieńczyć w stosunku 1:10

C) Metoda ezy: w łaźni wodnej o temp. 37°C należy ogrzać próbkę trombiny (poczekać do momentu ustabilizowania temperatury), a następnie do rurki hematokrytycznej o objętości 0,2 ml należy pobrać rozcieńczone osocze w celu oznaczenia hematokrytu.  Próbkę inkubować 2 minuty w łaźni wodnej (temp. 37°C), po czym dodać do niej 0,2 ml trombiny. Na tym etapie należy włączyć czasomierz i pobierać ezą (w równych odstępach czasu) próbkę, notując czas krzepnięcia. Prawidłowa wartość powinna mieścić się między 8 – 25 sekund [9].

 

Obliczenia:

Na podstawie zebranych wyników (uzyskanych różnymi metodami) oznacza się prawidłowe wartości czasu krzepnięcia trombiny. I tak, w przypadku rozcieńczenia próbki w stosunku 1:10, wartość oznaczenia można odczytać z dołączonej do zestawu ulotki. W przypadku zbiórki krwi do próbki z cytrynianem oraz dla normalnego hematokrytu, otrzymany wynik należy zwiększyć o 20% . Prawidłowe wartości powinny mieścić się w granicach 2,5 do 4,0 g/l [9].

 

Wykreślenie krzywej kalibracyjnej: na podstawie obliczeń należy wykreślić krzywą kalibracyjną, gdzie na osi odciętych nanosi się wartości rozcieńczonego osocza tj.: 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, zaś na osi rzędnych uzyskane czasy krzepnięcia.

W celu oznaczenia stosunku fibrynogenu do osocza należy skorzystać ze wzoru:

Stosunek w g/l =  n x k x Tr,

Gdzie:

Tr- stosunek fibrynogenu do osocza

k- współczynnik stężenia

n- odwrotność uzyskanego rozcieńczenia  [9].


Autor:Lidia Koperwas


Literatura:

[1]. Bajer-Czajkowska A., Nowacki P., Nocoń D., Podbielski J.,2002. Fibrynogen osoczowy a dynamika ostrej fazy udaru niedokrwiennego mózgu. Udar Mózgu 2002, tom 4, nr 2, 47–51. http://czasopisma.viamedica.pl/um/article/view/33769/24811

[2]. http://biotka.mol.uj.edu.pl/zbm/handouts/2013/AgJ/Wyklad_12.pdf

[3]. Ponczek M.B., 2010. Rola domen spokrewnionych z fibrynogenem w różnicowaniu i migracji komórek nowotworowych. Postępy Biologii Komórki, TOM 37 2010 NR 3 (539-552). http://www.pbkom.eu/sites/default/files/artykulydo2012/37_3_539.pdf

[4]. Undas A., Iwaniec T., Zawilska K., 2011. Problemy diagnostyki dysfibrynogenemii i hipofibrynogenemii wrodzonej- charakterystyka genetyczna pierwszych „polskich” fibrynogenów. Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 1, str. 31–41. http://pthit.pl/Acta_Haematologica_Polonica,Krwawienie_Dysfibrynogenemia_Hipofibrynogenemia_Fibrynogen_Mutacja_Zakrzepica,576.html

[5]. Ponczek M.B., 2010. Ewolucja układu homeostazy kręgowców. KOSMOS Problemy Nauk Biologicznych, Tom 59 2010, Numer 1-2 (286-287), S.83-90. http://kosmos.icm.edu.pl/PDF/2010/83.pdf

[6]. Muszbek L., Yee V.C., Hevessy Z., 1999. Blood Coagulation Factor XIII: Structure and Function. Thrombosis Research 94 (1999) 271-305. http://www.thrombosisresearch.com/article/S0049-3848%2899%2900023-7/abstract

[7]. Mosesson M.W., 2005. Fibrinogen and fibrin structure and functions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. Volume 3, Issue 8, p. 1894-1904, 2005. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1538-7836.2005.01365.x/full

[8]. Kłyszejko-Stefanowicz L, 2003. Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003, s.645-648.

[9]. http://chemklin.sum.edu.pl/uploaded/Fibrynogen.pdf, Stamarâ

[10]. Bijak M., Ponczek M.B., Nowak P., 2012. Komórkowa odpowiedź na działanie trombiny. Kosmos Problemy Nauk Biologicznych, Tom 61, Numer 3 (296), S. 445-454, 2012. http://kosmos.icm.edu.pl/PDF/2012/445.pdf

[11]. Para J., Krasiński R., Kostka B., 2006. Pomiar generacji trombiny- problemy metodyczne i znaczenie diagnostyczne. Praca finansowana przez Uniwersytet Medyczny w Łodzi, grant nr 502-13-229. http://diagnostykalaboratoryjna.eu/journal/DL_2006__1;_125-136.pdf

[12]. Stępień E., Plicner D., Branicka A., Stankiewicz E., Pazdan A., Śnieżek-Maciejewska E., Górkiewicz I., Kapelak B., Sadowski J., 2007. Czynniki wpływające na generację trombiny mierzoną jako stężenie kompleksów trombina-antytrombina i metodą automatycznego skalibrowanego trombogramu u chorych z zaawansowaną  chorobą wieńcową. Polskie Archiwum Medycyny Wewnętrznej 2007; 117(7). http://www.pamw.pl/sites/default/files/pamw_07_stepien_pl.pdf

 




Tagi: fibrynogen, fibryna, trombina, hematokryt, krzepnięcie, skrzep fibrynowy, izolowanie fibrynogenu, czas krzepnięcia trombiny
Drukuj PDF
wstecz Podziel się ze znajomymi

Recenzje



Informacje dnia: Ograniczenie soli w diecie może być groźne Nie mam jeszcze wniosków na temat pochodzenia Covid-19 Najdokładniejsze systemy satelitarnego transferu czasu Ponad połowa chorych z SARS-CoV2 cierpi na długi covid Zintegrować informacje o logistyce Wystawa "Nie to niebo" Ograniczenie soli w diecie może być groźne Nie mam jeszcze wniosków na temat pochodzenia Covid-19 Najdokładniejsze systemy satelitarnego transferu czasu Ponad połowa chorych z SARS-CoV2 cierpi na długi covid Zintegrować informacje o logistyce Wystawa "Nie to niebo" Ograniczenie soli w diecie może być groźne Nie mam jeszcze wniosków na temat pochodzenia Covid-19 Najdokładniejsze systemy satelitarnego transferu czasu Ponad połowa chorych z SARS-CoV2 cierpi na długi covid Zintegrować informacje o logistyce Wystawa "Nie to niebo"

Partnerzy

GoldenLine Fundacja Kobiety Nauki Job24 Obywatele Nauki NeuroSkoki Portal MaterialyInzynierskie.pl Uni Gdansk MULTITRAIN I MULTITRAIN II Nauki przyrodnicze KOŁO INZYNIERÓW PB ICHF PAN FUNDACJA JWP NEURONAUKA Mlodym Okiem Polski Instytut Rozwoju Biznesu Analityka Nauka w Polsce CITTRU - Centrum Innowacji, Transferu Technologii i Rozwoju Uniwersytetu Akademia PAN Chemia i Biznes Farmacom Świat Chemii Forum Akademickie Biotechnologia     Bioszkolenia Geodezja Instytut Lotnictwa EuroLab

Szanowny Czytelniku!

 
25 maja 2018 roku zacznie obowiązywać Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2016/679 z dnia 27 kwietnia 2016 r (RODO). Potrzebujemy Twojej zgody na przetwarzanie Twoich danych osobowych przechowywanych w plikach cookies. Poniżej znajdziesz pełny zakres informacji na ten temat.
 
Zgadzam się na przechowywanie na urządzeniu, z którego korzystam tzw. plików cookies oraz na przetwarzanie moich danych osobowych pozostawianych w czasie korzystania przeze mnie ze strony internetowej Laboratoria.net w celach marketingowych, w tym na profilowanie i w celach analitycznych.

Kto będzie administratorem Twoich danych?

Administratorami Twoich danych będziemy my: Portal Laboratoria.net z siedzibą w Krakowie (Grupa INTS ul. Czerwone Maki 55/25 30-392 Kraków).

O jakich danych mówimy?

Chodzi o dane osobowe, które są zbierane w ramach korzystania przez Ciebie z naszych usług w tym zapisywanych w plikach cookies.

Dlaczego chcemy przetwarzać Twoje dane?

Przetwarzamy te dane w celach opisanych w polityce prywatności, między innymi aby:

Komu możemy przekazać dane?

Zgodnie z obowiązującym prawem Twoje dane możemy przekazywać podmiotom przetwarzającym je na nasze zlecenie, np. agencjom marketingowym, podwykonawcom naszych usług oraz podmiotom uprawnionym do uzyskania danych na podstawie obowiązującego prawa np. sądom lub organom ścigania – oczywiście tylko gdy wystąpią z żądaniem w oparciu o stosowną podstawę prawną.

Jakie masz prawa w stosunku do Twoich danych?

Masz między innymi prawo do żądania dostępu do danych, sprostowania, usunięcia lub ograniczenia ich przetwarzania. Możesz także wycofać zgodę na przetwarzanie danych osobowych, zgłosić sprzeciw oraz skorzystać z innych praw.

Jakie są podstawy prawne przetwarzania Twoich danych?

Każde przetwarzanie Twoich danych musi być oparte na właściwej, zgodnej z obowiązującymi przepisami, podstawie prawnej. Podstawą prawną przetwarzania Twoich danych w celu świadczenia usług, w tym dopasowywania ich do Twoich zainteresowań, analizowania ich i udoskonalania oraz zapewniania ich bezpieczeństwa jest niezbędność do wykonania umów o ich świadczenie (tymi umowami są zazwyczaj regulaminy lub podobne dokumenty dostępne w usługach, z których korzystasz). Taką podstawą prawną dla pomiarów statystycznych i marketingu własnego administratorów jest tzw. uzasadniony interes administratora. Przetwarzanie Twoich danych w celach marketingowych podmiotów trzecich będzie odbywać się na podstawie Twojej dobrowolnej zgody.

Dlatego też proszę zaznacz przycisk "zgadzam się" jeżeli zgadzasz się na przetwarzanie Twoich danych osobowych zbieranych w ramach korzystania przez ze mnie z portalu *Laboratoria.net, udostępnianych zarówno w wersji "desktop", jak i "mobile", w tym także zbieranych w tzw. plikach cookies. Wyrażenie zgody jest dobrowolne i możesz ją w dowolnym momencie wycofać.
 
Więcej w naszej POLITYCE PRYWATNOŚCI
 

Newsletter

Zawsze aktualne informacje