W artykule zatytułowanym „Pokaż mi swoje DNA, a powiem Ci czym jesteś” omówiono zagadnienia związane z barkodingiem w kontekście identyfikacji genetycznej organizmów żywych należących do różnych jednostek taksonomicznych, w tym roślin.

Pojęcie barkodingu DNA zakłada, że można szybko i dokładnie określić gatunek w oparciu o amplifikację i sekwencjonowanie krótkich, ujednoliconych regionów DNA genomowego lub mtDNA do klasyfikacji zwierząt. Od niedawna, przez National Institutes of Health (NIH) do identyfikacji genetycznej roślin zaleca się badanie dwóch locus, a mianowicie ganów rbcL oraz matK [1].

Molekularna botanika systematyczna odgrywa coraz istotniejszą rolę w medycynie sądowej. Techniki oparte o badania DNA mają zastosowanie zarówno w sprawach karnych, gdy należy dowieść obecność podejrzanego na miejscu zbrodni, jak i do identyfikacji szczepów marihuany. Do badań porównawczych wykorzystuje się DNA pozyskane z poszczególnych okazów roślinnych znanych gatunków. Bardzo często materiał dowodowy stanowią mieszaniny roślin o nieznanej kompozycji. Identyfikacja genetyczna umożliwia rozdzielenie poszczególnych szczepów roślin oraz dostarcza dodatkowych informacji na podstawie ujawnionych śladów, które do tej pory często były ignorowane. Bazy National Center for Biotechnology Information (NCBI) zawierają liczne sekwencje DNA roślin, które mogą być stosowane do identyfikacji i analizy porównawczej dowodów botanicznych zebranych w trakcie śledztwa. W bazach przechowywane są zarówno sekwencje genów jądrowych, cpDNA oraz mtDNA [2].


Różne oblicza konopii

Bez wątpienia handel narkotykami stanowi poważny proceder, w którego zwalczanie są zaangażowane urzędy celne oraz inne organy ścigania. Instytucje te przeznaczają ogromne środki na zahamowanie importu i podaży nielegalnych środków odurzających, do których należy również marihuana [3]. Obecne prawo napiętnuje rozpowszechnianie marihuany [3], jednakże nie należy zapominać, że wiele historycznych podań wskazuje na właściwości lecznicze konopi [4].

Cannabis sativa L. (konopie siewne) jest jednym z kilku gatunków roślin o długiej historii uprawy używanej jako medykament. Prawdopodobnie leczenie substancjami zawartymi w konopiach zalecano chorym od co najmniej 10000 lat [5]. Poza mieszkańcami Indii, wartość leczniczą konopi znali również starożytni Chińczycy. Określenie taksonomicznej przynależności gatunków leczniczych występujących w różnych obszarach geograficznych jest problematyczne. Linneusz był zdania, że jest to jeden i ten sam gatunek, natomiast Lamarck ustalił, iż indyjski szczep różni się od gatunków konopi występujących na terenie Europy. W związku z czym dla rozróżnienia, konopiom występującym w Indiach nadał specyficzną nazwę Cannabis indica (konopie indyjskie). Za źródło pochodzenia konopi uważa się Azję Środkową, skąd to następnie rozprzestrzeniły się na obszar krajów śródziemnomorskich, docierając także na teren Europy Wschodniej i krajów Europy Środkowej [6]. Trudno jest określić dokładne źródło pochodzenia roślin ze względu na ich wielowiekową historię upraw. Z pomocą przychodzą badania na poziomie molekularnym. Analiza sekwencji nukleotydowej DNA próbek pobranych w trakcie prowadzenia wykopalisk archeologicznych  oraz świeżych próbek roślin dostarcza informacji na temat ewolucji gatunku [4].

Które geny wybrać do analizy?

Najszerzej scharakteryzowanym locus u wszystkich gatunków roślin jest duża podjednostka rybulozo – 1,5 – karboksylazy bisfosforanu (rbcL). Gen rbcL zlokalizowany jest w genomie chloroplastów. Baver i wsp. wytypowali locus rbcL jako układ modelowy  do opracowania molekularnej metody identyfikacji gatunkowej roślin. W swoim wyborze kierowali się wysoką liczebnością występowania w komórkach roślinnych oraz obszernością przebadanych sekwencji DNA znajdujących się w bazie danych NIH [2].

Drugim kandydatem, sugerowanym  przez Consortium for the Barcode of Life (CBOL) Plant Working Group, do zastosowania w procesie barkodingu jest gen matK (ang. maturase K gene). Gen matK składa się z ok. 1570 par zasad i koduje białko maturazy. Region kodujący matK zazwyczaj znajduje się w obrębie intronu chloroplastowego genu trnK.  Badania prowadzone nad analizą genu matK dowodzą, że region ten w wysokim stopniu umożliwia różnicowanie gatunków, Niestety pod względem technicznym, amplifikacja sekwencji kodującej wybrany region DNA jest utrudniona, ze względu na powtarzalność występujących po sobie, pojedynczych nukleotydów [7].

Na całym świecie trwają badania nad licznymi obszarami DNA roślin, na podstawie których, również jest możliwa ich identyfikacja i klasyfikacja. Badania filogenetyczne wielu gatunków oparte są w dużym stopniu na analizie polimorficznych loci DNA chloroplastowego, np. trnL, trnF, intronu tRNA, które to regiony wykazują dużą zmienność w obrębie haplotypów [3], [4].

Przykładowe zastosowanie technik molekularnych

Identyfikacji genetycznej roślin można dokonywać z wykorzystaniem techniki losowej amplifikacji polimorficznego DNA, tzw. RAPD-PCR (ang. Randomly Amplified Polymorphic DNA), która pozwala odróżnić od siebie badane osobniki. Metodę RAPD po raz pierwszy zastosował w 1990 r. Williams i wsp. [9]. Podobnie jak PCR przebiega ona w trzech następujących po sobie etapach, czyli denaturacja matrycy, przyłączanie starterów oraz wydłużanie łańcucha DNA z optymalnie ustalona liczbą powtórzeń. To co odróżnia standardową technikę PCR od RAPD to specyfika doboru oligonukleotydowych starterów.  W metodzie RAPD wykorzystuje się pojedynczy, krótki starter o długości od 5 do 15 dowolnie wybranej sekwencji nukleotydów. Taki starter przyłącza się do obu nici DNA w kilku miejscach jednocześnie, co przyczynia się do powstania od kilku nawet do kilkunastu produktów amplifikacji. Podczas gdy, do przeprowadzenia reakcji PCR stosuje się dwa różne startery, gdzie każdy przyłącza się tylko do jednej nici DNA. Wyniki badań uzyskane z wykorzystaniem techniki RAPD-PCR prezentuje się w postaci żeli, po rozdziale elektroforetycznym produktów reakcji losowej amplifikacji polimorficznego DNA. [8]

Przedstawioną  powyżej metodę do identyfikacji genetycznej Cannabis sativa wybrali  Gillan R. i wps. [10] oraz Jagadish V. i wsp. [11], co można uzasadnić próbą ominięcia problemów związanych ze słabo poznaną sekwencją nukleotydów budujących analizowany region DNA. Jednakże, Linarce i wsp. [3] uznali, że technika ta nie jest wystarczająco miarodajna, ze względu na losowość amplifikowanych fragmentów nici DNA. W badaniach mających na celu wskazanie specyficznych starterów do identyfikacji gatunkowej na podstawie analizy polimorfizmu dwóch chloroplastowych genów: trnL, trnF, zdecydowali się na klasyczną metodę PCR.

Podstawowy materiał do badań nad C. sativa stanowiły liście czterech różnych roślin. Pierwszy okaz pochodził z Indii pozostałe trzy z Afryki Południowej. Wyizolowane DNA z czterech różnych liści stanowiło matrycę reakcji PCR. W pierwszej kolejności DNA amplifikowano ze starterami uniwersalnymi: C oraz F (Tab.1.). Długość uzyskanych produktów wynosiła ok. 818 par zasad, co pokrywa się z dotychczasowymi danymi literaturowymi. Każdy z czterech produktów został zsekwencjonowany. Stopień homologii pomiędzy dwoma okazami C. sativa pochodzącymi z Afryki Południowej wynosił 97,5%. Dodatkowo uzyskane sekwencje nukleotydowe porównano z danymi zgromadzonymi w EMBL Nucleotide Sequence Database (EMBL-Bank). Na podstawie przeprowadzonych analiz wykazano wysoki współczynnik homologi sekwencji C. sativa oraz Nicotinia, wynoszący 68% [3].