Zdjęcie:  Struktura cząsteczki przeciwciała , [4].

W przypadku, gdy cząsteczka IgG zostanie strawiona jakimś enzymem (np. papainą lub pepsyną), dochodzi do podziału cząsteczki na fragmenty.
Pepsyna odcina fragmenty ciężkich łańcuchów poniżej pierwszego wiązania disulfidowego w regionie zawiasowym. W wyniku tego dochodzi do powstania dwuwalencyjnego fragmentu (Fab’)2, który złożony jest z ramion IgG połączonych mostkiem disulfidowym, a także fragment Fc, który zawiera pozostałości łańcuchów ciężkich. W przypadku hydrolizy przeciwciałą papiną, wiązania disulfidowe pozostają w obrębie fragmentu Fc, zaś ramiona cząsteczki IgG występują osobno jako jednowalencyjne fragmenty Fab [3].

Papaina (proteaza) tnie IgG uwalniając z jej cząsteczki (o kształcie litery Y) dwa fragmenty tworzące ramiona. Każdy z tych fragmentów zawiera pojedyncze  miejsce wiążące antygen, przez co nazywane jest fragmentem Fab (ang. fragment antigen bnding).  Z racji tego, że fragmenty Fab zawierają pojedyncze miejsce wiązania antygenu nie mają zdolności wiązania antygenów poprzecznie (są jednowartościowe).  Uwolniony w wyniku cięcia trzon cząsteczki mający kształt litery Y, zbudowany z odcinków łańcuchów ciężkich, które położone są na końcu C, określany jest fragmentem Fc (ang. cristallization), ponieważ łatwo ulega on krystalizacji [4].

Do szybkiego oczyszczania fragmentów Fab oraz (Fab’)2 z fragmentów Fc można wykorzystać złoże z kowalencyjnie związanym białkiem A. W trakcie przepływu mieszaniny białek przez kolumnę, białko A selektywnie wychwytuje fragmenty Fc oraz niestrawione cząsteczki IgG. W wypływającym z kolumny materiale znajdują się fragmenty Fab lub (Fab’)2 zależne od uzytwgo enzymu. Po elucji ze złoża materiału związanego z białkiem A, fragmenty Fc można oczyścić z całych cząsteczek IgG stosując w tym celu filtrację żelową (pozwala na to znaczna różnica między masami cząsteczkowymi tych białek : IgG= 160 kDa, a Fc= 50 kDa) [3].

Izolowanie fragmentów Fab i Fc immunoglobulin z wykorzystaniem białka A (G. Stingl i wsp., 1977)

Wykonanie:
Złoże Protein A Sepharose CL-4B w objętości 2 ml należy umieścić w plastikowej kolumnie, po czym przemyć je 10 ml buforu fosforanowego (0,2 M bufor fosforanowy o pH= 7,5). Próbkę hydrolizatu IgG (10 ml) powstałą po trawieniu papainą należy rozcieńczyć buforem fosforanowym do stężenia białka nie przekraczającego 1 mg/ml.  Próbkę hydrolizatu przepuścić przez kolumnę i zbierać wypływający z kolumny materiał w postaci 1 ml frakcji [6].
W trakcie przepływu próbki przez kolumnę zachodzi adsorpcja fragmnetów Fc i niestrawionych cząsteczek IgG na białku A, zaś fragmenty Fab wypływają z kolumny bez oddziaływań. Kolumnę przemyć 10 ml buforu fosforanowego ,następnie 10 ml  buforu fosforanoweg  z dodatkiem NaCl (0,2 M bufor fosforanowy -1 M NaCl pH=7,5), a na sam koniec 10 ml samego buforu fosforanowego.  Specyficznie związane białka należy wyeluować za pomocą buforu cytrynianowego (0,1 M bufor cytrynianowy o pH= 3,5) i zbierać frakcje w objętości 1 ml , po czym oznaczyć je spektrofotometrycznie przy λ=280 nm.  Frakcje, które zawierają fragmenty Fc należy poddać dializie wobec buforu fosforanowego o pH= 7,5. P rozdziale chromatograficznym złoże należy przemyć 40 ml wody, a dalej 10 ml 20% etanolu. Tak przygotowane złoże można przechowywać w 4^oC [3], [6].
Na podstawie rozdziału elektroforetycznego można ocenić czystość oraz jakośc wyizolowanych fragmentów Fab i Fc ( rozdział w 7,5% żelu poliakryloamidowym z dodatkiem SDS). Podczas rozdziału, fragmenty Fab powinny wędrować  w żelu jako bialka o masie cząsteczkowej 55 kDa i 25 kDa- odpowiednio przed i po redukcji ,ostków disulfidowych. Fragmenty Fc w tych samych warunkach rozdziału powinny wędrowac jako białka o m.cz. 50 kDa i ok. 25 kDa [3], [6].

Zastosowanie konkanawaliny A (Con A)do frakcjonowania glikoprotein i glikolipidów osocza krwi (V.G. Shore)

Konkanawalina A oddziałuje z resztami cukrowymi i ma powinowactwo do glukozy, oddziałuje z resztami cukrowymi, dzięki czemu reakcję tą wykorzystuje się powszechnie do frakcjonowania cząsteczek białkowych oraz lipoproteinowych , które to zawierają boczne łańcuchy wielocukrowe. W zależności od liczby oraz umiejscowienia reszt cukrowych, zawierające je cząsteczki różnią się pod względem powinowactwa oddziaływania z unieruchomioną na nośniku konkanawaliną [7].

Wykonanie:
Jako materiał do badań należy użyć mrożonego osocza człowieka lub świni.
5 ml rozmrożonego osocza należy rozcieńczyć do objętości 50 ml za pomocą buforu A(tj.: 0,1 M bufor fosforanowy, 0,5 M NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 o pH= 7,5). Następnie, korzystając z wyjściowych roztworów glukozy i mannozy (o znanym stężeniu), należy przygotować ich rozcieńczenia w objętości 10 ml każde,  tj: 0,1 M; 0,2 M; 0,3 M oraz 0,4 M ( do rozcieńczeń użyć buforu A). Złoże Con A Sepharose 4B w obj. 10 ml upakować w kolumnie, po czym przemyć je 100 ml buforu A. Dalej, na kolumnę nanieść rozcieńczoną próbkę osocza, a następnie kolumnę ponownie przemyć 100 ml buforu A [3], [7].
Białka należy najpierw eluować za pomocą roztworu glukozy, przepuszczając przez złoże po 10 ml wcześniej przygotowanych roztworów  w porządku narastającego stężenia glukozy (0,5 M roztwór glukozy w buforze A itd.). Z roztworami mannozy postąpić w identyczny sposób. Na końcowym etapie rozdziału, przez kolumnę przepuścić 50 ml  buforu boranowego o pH=6.0. W trakcie całej elucji należy zbierać 2 ml frakcje i oznaczać je spektrofotometrycznie w celu oznaczenia stężenia białka [7].
Po zakończonym rozdziale kolumnę przemyć 100 ml buforu A, oraz 20 ml buforu A z dodatkiem NaN3 (0,01% roztwór NaN3 w buforze A). Przemyta kolumna może być przechowywana w 4^oC. 

W celu polepszenia wyników rozdziału chromatograficznego poszczególnych frakcji, w celu elucji białek można zastosować gradient liniowy stężenia glukozy i mannozy, zamiast ich gradientu skokowego [3], [7].
Plazminogen (Plg) jest białkiem wytwarzanym przez wątrobę . Ponadto , jest on wydzielany do osocza w postaci nieaktywnego prekursora proteazy serynowej tj.  plazminy. Plazminogen jest syntetyzowany jako polipeptyd o długości 810 aminokwasow, zaś po odcięciu tzw.  sekwencji liderowej, natywne białko składa się z 791 aminokwasów [1].
Ludzki plazminogen należy do  glikoprotein. Wiązanie plazminogenu na powierzchni komórek patogenów, które atakują ustrój człowieka, a także jego aktywacja do plazminy jest jednym z mechanizmów inwazyjności. To właśnie taki sposób ułatwia migrację drobnoustrojów, a także  wpływa na kolonizację tkanek zaatakowanego organizmu [1].
Enolaza jest białkiem wiążącym plazminogen na powierzchni komórek prokariota. Jej obecność opisano po raz pierwszy w grupie A streptokokow – Streptococcus pyogenes [1].
Enolaza wyeksponowana na powierzchni komórek może stanowić receptor dla pewnych ligandów. Szczególnie interesująca jest  receptorowa rola enolazy wobec plazminogenu ludzkiego. System enolaza-plazminogen (plazmina) jest jednym z mechanizmów ułatwiających inwazyjność patogenów w ustroju człowieka. Ponadto,  pełni istotną rolę w procesie miogenezy, a także w rozroście tkanek nowotworowych. Obecność enolazy na powierzchni komórek patogenów atakujących ustrój człowieka jest też źródłem generowania przeciwciał, co stanowi podłoże rozwoju rożnych chorób autoimmunologicznych [1].

Izolowanie plazminogenu z zastosowaniem złoża zawierającego lizynę (D.G. Deutsch, 1970)

Plazminogen jest selektywnie adsorbowany z osocza przez lizynę, która to związana jest kowalencyjnie ze złożem Sepharose 4B.  Gdy odmyjemy nieswoiście związane białka osocza, proenzym ten można wyeluować z żelu Lysine Sepharose 4B używając 0,2 M roztworu kwasu ε-aminokapronowego (kwas 6-aminoheksanowy) [8].
W złożu Lysine Sepharose 4B, L-lizyna połączona jest za pośrednictwem grupy α-aminowej, pozostawiając zarówno grupę α-aminową jak i grupy α-karboksylowe wolne, dzięki czemu mogą one swobodnie współpracować z substancjami próbki podczas chromatografii.  Żel Lysine Sepharose 4B przeznaczony jest do oczyszczania cząsteczek biospecyficznych [9].

Wykonanie:
10 ml żelu Lysine Sepharose 4B należy przemyć 2x za pomocą  0,1 M buforu fosforanowego o pH= 7,4 (należy wykorzystać ok. 30 ml buforu). Przemyty żel upakować w plastikowej kolumnie. Rozmrożone 20 ml osocza uzupełnić do 200 ml 0,1 M buforem fosforanowym, po czym przepuścić przez przygotowaną wcześniej kolumnę. Nieswoiście zaadsorbowane białka należy odmyć  z kolumny  używając w tym celu 0,3 M bufor fosforanowy o pH=7,4 (50 ml). Związany swoiście z lizyną plazminogen wymyć 0,2 M roztworem kwasu ε-aminokapronowego  (30 ml), po czym zbierać wypływający z kolumny materiał w 2 ml frakcjach.
Po zebraniu frakcji, kolumnę kolejno przemyć:
- 30 ml  0,1 M buforu fosforanowego
- oraz 30 ml 0,01 % roztworu NaN3 w 0,1 M buforze fosforanowym o pH= 7,4. Po przemyciu kolumnę przechowywać w temperaturze 4^oC.
Frakcje, w których znajduje się plazminogen zidentyfikować spektrofotometrycznie przy λ= 280 nm, usunąć z nich kwas ε-aminokapronowy, stosując w tym celu dializę wobec 0,05 M buforu fosforanowego o pH= 7,4. (lub filtrację żelową na kolumnie wypełnionej złożem Sephadex G-25). Całą preparatykę prowadzić w temperaturze 4^oC [3], [8].

Oczyszczanie mRNA z zastosowaniem złoża zawierającego poli(U) (J.M. Taylor)

Poli(U) Sepharose 4B może być użyta do izolacji poli(A). Złoże to jest adsorbentem, który specyficznie a także w odwracalny sposób wiąże kwasy nukleinowe pochodzenia roślinnego oraz mRNA.  Złoże to przygotowuje się przez związanie długich łańcuchów kwasu poliurydylowego  (tj. ok. 100 podjednostek) z żelem Sepharose 4B.
Prawie wszystkie cząsteczki mRNA mają w swojej strukturze sekwencję kwasu poliadenylowego [poli(A)], która to jest komplementarna do sekwencji poli(U). Dzięki wykorzystaniu komplementarności obydwu zasad, możliwe jest łatwe wyizolowanie cząsteczek mRNA w drodze chromatografii powinowactwa [3], [5].

Materiał:
Jako materiał do badań należy użyć odwodniony preparat całkowitego RNA.

Wykonanie:
W wodzie destylowanej rozpuścić DEPC (0,1% dietylopirowęglan). Całość poddać działaniu DEPC przez 12 godzin, a następnie wyautoklawować. Wszystkie bufory użyte w doświadczeniu muszą zostać przygotowane na wodzie z DEPC [10].
Odważyć 1 g żelu Poly(U)-Sepharose 4B , nanieśc na szklany filt, po czym przemyć 0,1 M roztworem NaCl (100 ml). Tak przygotowane złoże  (ok. 5-10 ml) upakować w szklanej kolumnie, którą wcześniej należy wyautoklawować.  Tak upakowaną kolumnę przemyć 100 ml buforu startowego (tj. 25% roztwór formamidu w układzie: 50 mM Tris-HCl, 0,7 M NaCl, 10 mM EDTA o pH= 7,5).  Ok. 1-3 g próbki RNA rozpuścić w buforze ekstrakcyjnym (tj. 50 mM Tris-HCl, 1% N-lauroilosarkozyna, 30 mM EDTA o pH= 7,5), całośc podgrzać do temperatury 65^oC i utrzymywać w tej temp. przez około 5 min., a następnie szybko schłodzić na lodzie i rozcieńczyć 5-krotnie za pomocą buforu startowego [10].

Przygotowaną w  ten sposób próbkę przepuścić przez kolumnę z żelem Poly(U)-Sepharose 4B. Kolumnę przemyć 100 ml buforu startowego w celu usunięcia niespecyficznie zaadsorbowanych cząsteczek [10].

Cząsteczki mRNA (umocowane za pomocą wiązań wodorowych), można wymyć za pomocą buforu do elucji (ok. 20 ml), który zawiera dużą ilość, b aż 90% formamidu, i zbierać 1  ml frakcje (eluaty). Zebrane eluaty oznacza się spektrofotometrycznie przy λ=254 nm. Jako próbę referencyjna należy zastosować bufor do elucji.  Na koniec, kolumnę ponownie przemyć 100 ml buforu do elucji, a dalej buforem startowy (100 ml). Tak przygotowaną kolumnę można przechowywać w temperaturze 4^oC do 4 tygodni [3], [10].

Autor: Lidia Koperwas

Literatura:
[1]. Sewery E., Pietkiewicz J.,  Szamborska A, Gamian A., 2007. Enolase on the surface of prockaryotic and eukaryotic cells is a receptor for human plasminogen. Postepy Hig Med Dosw. (online), 2007; 61: 672-682
[2]. http://www.biofizyka.p.lodz.pl/ch8.pdf
[3]. Kłyszejko-Stefanowicz L, 2003. Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003, s. 158- 163
[4]. Hames D.B., Hooper N.M., 2009. Biochemia-krótkie wykłady. Wydawnictwo Naukowe PWN, s. 117-118
[5]. http://www.gene.mie-u.ac.jp/Protocol/M&M/Poly%28U%29%20sepharose.html
[6]. Stingl G., Wolff-Schreiner E.C., Pichler W.J., Gschuait F., Knapp W., Wolff K., 1977. Epidermal Langerhans cells bear Fc and C3 receptors. Nature, 268: 245-246
[7].Shore V.G., Shore B., 1973. Heterogenity of human plasma very low density lipoproteins. Separation of species differing in protein components. Biochemistry, 12 : 502- 507.
[8]. Deutsch D.G., Mertz E.T., 1970. Plazminogen: Purification from human plasma by affinity chromatography. Science, 170 : 1095- 1096.
[9].https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1314729545976/litdoc71709500AE_20110830205431.pdf
[10]. Taylor J.M., Tse T.P.H., 1976. Isolation of rat liver albumin messenger RNA. J. Biol. Chem. 251: 7461- 7467.