Rysunek 4. Na rysunku przedstawiono istotę procesu SELEX, w którym podany schemat powtarzany jest wielokrotnie do uzyskania pojedynczej sekwencji oligonukleotydu [4].

Pierwszym etapem procesu jest utworzenie kombinatorycznej biblioteki DNA lub RNA na drodze syntezy chemicznej - bibliotekę tworzy 1014-1015 makrocząsteczek  o określonej długości i różnych „kształtach”. Każdy z oligomerów w takiej bibliotece posiada fragment środkowy o zupełnie przypadkowej sekwencji nukleotydowej i jest oflankowany od końca 5' i 3' sekwencjami stałymi.

W trakcie syntezy regionu zmiennego stężenia monomerów A, T ( lub U), G i C w mieszaninie reakcyjnej są równomolowe, aby prawdopodobieństwo wystąpienia każdej kombinacji nukleotydów było jednakowe. W przypadku n-nukleotydowego fragmentu daje to 4n różnych kombinacji. Tym samym otrzymuje się pulę oligonukleotydów reprezentujących teoretycznie każdą możliwą sekwencję nukleotydów.

Kolejnym etapem procesu jest selekcja oligonukleotydów specyficznie wiążących daną cząsteczkę. Pulę oligonukleotydów DNA lub RNA poddaje się inkubacji z cząsteczką docelową w określonych warunkach pH, temperatury itp. Cząsteczka docelowa jest zwykle unieruchomiona na błonie nitrocelulozowej. Te z sekwencji, które wiążą się specyficznie do molekuły nie ulegają usunięciu w wyniku następującego płukania i są powielane metodą PCR (lub PCR sprzężonego z odwrotną transkrypcją w przypadku biblioteki RNA). Proces selekcji powtarza się stopniowo zaostrzając warunki reakcji. W czasie każdej z rund i płukań wzrasta udział oligonukleotydów rozpoznających specyficznie cząsteczkę docelową.

Ostatnim etapem procesu jest powielenie wyselekcjonowanych aptamerów. Uzyskane w wyniku kilku lub kilkunastu cykli selekcji oligonukleotydy testuje się pod względem siły wiązania (wyznacza się stałą dysocjacji (Kd) powstałego kompleksu) oraz powinowactwa, a następnie te najlepsze wprowadza do plazmidów i klonuje w komórkach bakteryjnych, po czym sekwencjonuje. Po poznaniu niepowtarzalnej sekwencji nukleotydowej wytwarza się wiele kopii danego aptameru drogą syntezy chemicznej.

Modyfikacje aptamerów

W celu optymalnego wykorzystania aptamerów często modyfikuje się wyselekcjonowane oligonukleotydy, aby zwiększyć ich stabilność, powinowactwo do cząsteczki docelowej lub też umożliwić ich detekcję dostępnymi metodami analitycznymi.

Dimeryzacja wyselekcjonowanych aptamerów pozwala na wielokrotny wzrost powinowactwa liganda do badanej molekuły oraz wzrost trwałości utworzonego kompleksu. Oligonukleotydy po dimeryzacji mają większą liczbę miejsc wiążących, dlatego możliwe jest ich oddziaływanie z więcej niż jedną cząsteczką docelową.

Alkilacja kwasów nukleinowych prowadzi do otrzymania aptamerów zawierających 2`-O-metylopirymidynę. Takie zmodyfikowane aptamery są stabilniejsze i bardziej odporne na ataki enzymów  egzonukleolitycznych.
Podstawienie grupy 2`-OH rybozy grupą aminową lub atomami fluoru tysiąckrotne zwiększa odporność na degradację (ciecie) w surowicy krwi przez obecne w niej enzymy.

Wytwarzanie tioaptamerów poprzez modyfikację reszt fosforanowych polegaj na zastąpieniu jednego lub więcej atomów tlenu atomami siarki. Tak zmodyfikowane oligonukleotydy są bardziej odporne na trawienie przez 3`-egzonukleazę.

LNA (ang. Locked Nucleic Acids) polega na wprowadzeniu mostków metylenowych łączących atomy 2'-O i 4'-O w pierścieniu rybozy. Zabieg ten chroni przed degradacją nukleolityczną.

Konstrukcja koliście zamkniętych aptamerów tzw. aptamerów polegająca na ligacji wolnych końców. Kaptamery są znacznie stabilniejsze, a jednocześnie modyfikacja ta nie wpływa na ich zdolności rozpoznawania cząsteczek docelowych.

Tworzenie aptamerów L-DNA i L-RNA (aptamery lustrzane). Wykorzystuje się stereoselektywność enzymów komórkowych wykazujących aktywność tylko w stosunku do enancjomerów występujących w przyrodzie np. rybonukleazy mogą rozpoznać i hydrolizować tylko oligorybonukleotydy oparte na szeregu D-rybozy natomiast nie degradują enancjomerów RNA zawierających L-rybozę.

Znakowanie cząsteczek aptamerów przy pomocy izotopów 3H lub 32P pozwala na monitorowanie kolejnych rund selekcji oraz wykorzystywane jest w diagnostyce obrazowej.

Koniugacja z barwnikami fluorescencyjnymi. W tym celu stosuje się tzw. cząsteczki pomostowe które umożliwiają wyznakowanie aptameru bez utraty jego powinowactwa, jak i zachowanie właściwości fluorescencyjnych barwnika. Odpowiednie znakowanie (np. w miejscu pobliskim obszarowi rozpoznania międzycząsteczkowego) pozwala na śledzenie zmian konformacyjnych aptameru po związaniu docelowej cząsteczki, a sam aptamer pełni rolę biosensora.

Aptamery nukleinowe i przeciwciała

Specyficzność działania aptamerów porównywana jest z przeciwciałami monoklonalnymi. Jednakże oba rodzaje molekuł biologicznie czynnych wykazują zasadnicze różnice (Tab. 1).

Tabela 1. Zestawienie różnic we właściwościach przeciwciał i aptamerów nukleinowych.

Rysunek 5. Na rysunku przedstawiono zastosowanie aptameru TTA1 jako nośnik radioizotopu diagnostycznego 99mTc skompleksowanego przez chelator MAG2 oraz MAG2-PEG3400 (z lewej od góry), radioizotopu diagnostycznego 111In skompleksowanego przez chelator DTPA oraz barwnika fluorescencyjnego rodaminy red-X [5].

Terapia celowana z wykorzystaniem nośnika aptamerowego

Aptamery stosowane w celowanej terapii antynowotworowej są najczęściej nośnikami nanocząstek polimerowych, które zawierają w swej strukturze leki antymitotyczne typu paklitaksel (ang. paclitaxel, PTX) (Rys. 6). Lek tego typu hamuje podział komórki nowotworowej, przez co jej rozprzestrzenianie zostaje zatrzymane w odpowiedniej fazie.

Aptamer umiejscowiony jest na końcu łącznika (ang. spacer), który oddala go od nanocząstki (eliminacja efektów sterycznych) oraz nadaje całej strukturze odpowiednich właściwości hydrofobowych (rozpuszczalność w błonach cytoplazmatycznych). Takimi łącznikami są najczęściej polimery na bazie glikolu polietylowego (PEG) zakończone wolna grupą aminową. Do tej grupy poprzez wiązanie peptydowe przyłączana jest nanocząstka polimerowa, w której uprzednio zamknięto lek antymitotyczny (PTX-NP).