Akceptuję
W ramach naszej witryny stosujemy pliki cookies w celu świadczenia państwu usług na najwyższym poziomie, w tym w sposób dostosowany do indywidualnych potrzeb. Korzystanie z witryny bez zmiany ustawień dotyczących cookies oznacza, że będą one zamieszczone w Państwa urządzeniu końcowym. Możecie Państwo dokonać w każdym czasie zmiany ustawień dotyczących cookies. Więcej szczegółów w naszej Polityce Prywatności

Zamknij X
Strona główna Start

Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym


Elektroforeza jest zjawiskiem elektrokinetycznym, w wyniku którego pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego dochodzi do przemieszczania się makrocząsteczek obdarzonych niezrównoważonym ładunkiem elektrycznym. Prędkość przemieszczania się naładowanej elektrycznie makrocząsteczki zależy od kilku czynników tj.:  od jej ładunku, rozmiaru, kształtu oraz oporów ruchu środowiska. Wykorzystując elektroforezę możliwe jest szybkie separowanie makrocząsteczek takich jak: kwasy nukleinowe (DNA, RNA) czy białka [4].  Wyróżnia się kilka rodzajów elektroforezy, które różnią się między sobą składem żeli elektroforetycznych, warunkami rozdziału, a także zastosowaniem: inny rodzaj elektroforezy stosuje się do rozdziału kwasów nukleinowych, a inny do rozdziału białek.


Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym

Żele poliakrylamidowe są polimerami akrylamidu i bisakrylamidu, a od ich proporcji zależy gęstość żelu oraz wymiary porów. Gęstośc żelu dobiera się w zależności od wielkości analizowanych cząsteczek (tj. w zależności od ich masy cząsteczkowej). W przypadku wysoko-cząsteczkowych białek do rozdziału używa się żeli o niższej gęstości, zaś białka nisko-cząsteczkowe rozdziela się w żelach bardziej gęstych. W żelach 8% możliwe jest rozdzielanie cząsteczek o wielkości od 24 kDa do 205kDA, żele 10% stosuje się do rozdzielania cząsteczek o masie od 14kDa – 205 kDa, a żele 12% do rozdziału 14-66 kDa cząsteczek [9].


Elektroforeza w obecności SDS

Do rozdziału białek najczęściej stosuje się elektroforezę w obecności SDS tj. siarczanu dodecylu sodu (tzw. SDS-PAGE). SDS jest substancją powierzchniowo czynną, która przyczynia się do poprawy rozdzielczości danej techniki elektroforetycznej. Zastosowanie siarczanu dodecylu sodu podczas rozdziału przynosi wiele korzyści, ponieważ  większość białek jest rozpuszczalna w elektrolitach zawierających SDS (a szczególnie takie po redukcji mostków disiarczkowych), a ponadto separacja (rozdział) białek odbywa się zgodnie z ich masami cząsteczkowymi. Należy również dodać, że barwienia kompleksów tworzonych przez białko i SDS jest znacznie wydajniejsze niż barwienie samego białka, a dodatkowo obecność SDS skutecznie eliminuje enzymatyczną degradację białek w trakcie ich separacji [4], [1]. SDS nadaje polipeptydom ładunek ujemny, dzięki czemu moga one migrować w polu elektrycznym. Ilość związanego SDS przez białko jest prawie zawsze liniowo zależna od masy danego polipeptydu, co z wykorzystaniem markera masy umożliwia wyznaczanie masy rozdzielanych białek [1]. SDS powoduje zrywanie prawie wszystkich wiązań niekowalencyjnych w białku, co w konsekwencji prowadzi do rozfałdowania się łańcucha polipeptydowego [6].

 
Elektroforeza natywna

Ten rodzaj elektroforezy prowadzi się w poliakrylamidzie, w warunkach, w których makrocząsteczki pozostają niezdenaturowane, dzięki czemu możliwe jest odzyskanie cząsteczek białkowych w stanie pełnej aktywności biologicznej. Próbka nałożona na żel rozpuszcza się w buforze, który nie powoduje denaturacji zawartych w niej białek. Elektroforeza natywna jest przeciwieństwem elektroforezy przeprowadzanej w obecności czynników denaturujących (np. SDS).  Wadą metody jest słaba rozdzielczość [7], [9].
 W celu rozdziału białek w zależności od ich masy cząsteczkowej, próbkę przed nałożeniem na żel należy zredukować w odpowiednim buforze (tzw. buforze redukującym) oraz odpowiedniej temperaturze. Związkami redukującymi (w buforach redukujących) najczęściej są:
- merkaptoetanol oraz
- DTT (ditiotreitol), związki te przecinają (redukują) mostki disiarczkowe (S-S) pomiędzy białkami. 

Elektroforeza zachodzi najefektywniej, gdy objętość próbki nakładanej na żel nie przekracza 10% objętości ścieżki, a ilość białek nakładanych na studzienkę znajduje się w pzredziale od 1 do 50 µg. Ważne jest również, by próbka nie zawierała zbyt dużych ilości soli wystęujących w postaci zjonizowanje, ponieważ powodują one powstawanie smug na żelu podczas rozdziału oraz niejednorodność prążków[9].

Przygotowanie próbek do elektroforezy: 

Bufor do próbek (2 x stężony) - przepis wg mercka(hefera):
- 0,5 M TRIS-HCl o pH 6,8 (stężenie końcowe 0,125 M)
- 4% SDS (siarczan dodecylu sodu)
- 20 %glicerol
- bromofenol blue (dodawać kroplami do uzyskania odpowiedniego granatowego koloru) 
Bufor do elektroforezy (5x stężony) :
- 25mM Tris
- 192 mM glicyna
- 0.1% SDS (pH 8.3)

Wykonanie:

Badane białko (1ng-50µg) zawiesić w buforze do próbek. Docelową objętość jaka ma być nałożona na studzienkę (około 10-30 µl) należy  podzielić na pół:  jedną połowę stanowi bufor do próbek (stężony 2x), a drugą badana próbka rozcieńczona w odpowiedniej ilości wody, lub buforu do elektroforezy. 
 Tak otrzymane próbki należy zredukować, dodając  w tym celu  1% merkaptoetanol lub DTT. Redukcję próbek prowadzić przez 5 minut w temperaturze  100°C. Bezpośrednio przed naniesieniem próbek na żel, należy je odwirować celem usunięcia  wszystkich nierozpuszczonych składników. Tak przygotowane próbki można nanieść na studzienki w żelu poliakryloamidowym. 
Rozdział elektroforetyczny prowadzić w buforze do elektroforezy poczatkowo przy napięciu 80V -20 minut (mniejsze napięcie ma na celu wyrównanie ładunków w żelu oraz wolniejszą migrację białek w żelu zbierającym), a następnie przy zwiększonym napięciu  (150 V przez ok. 50 minut) [9].

Elektroforeza nieciągła

Prowadzi do jeszcze lepszych rezultatów rozdziału (separacji)  białek, a dodatkowo otrzymuje się bardzo ostre prążki, które zawierają białka charakteryzujące się taką samą ruchliwością elektroforetyczną (często interpretowane jako białka o tej samej masie cząsteczkowej) [7].

Przygotowanie żelu poliakrylamidowego do rozdziału białek

Żele polakrylamidowe przygotowywane są z roztworu monomerów akryloamidu oraz z substancji sieciujących określanych często jako cross-linkers. Substancją sieciującą najczęściej jest N,N’-metylenobisakryloamid (bisakryloamid). APS (nadsiarczan amonu) stosuje się do zainicjowania chemicznej  polimeryzacji żelu , będącą  reakcją wolnorodnikową. Reakcja ta zachodzi w obecności katalizatora, którym najczęściej jest TEMED (N,N,N’,N’-tetrametyloetylenodiamina) [2], [3], [5].
 

Zdjęcie: Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym, [6].

Wykananie:

Żel poliakrylamiodowy przygotowuje się (wylewa) dwustopniowo: jako pierwszy przygotowuje się   żel rozdzielający o procentowości zależnej od wielkości rozdzielanych cząsteczek. W żelu rozdzielającym zachodzi  właściwy rozdział białek.

Na wylany żel rozdzielający nanosi się izobutanol (w celu usunięcia ewentualnych pęcherzyków powietrza ). Dodatkowo izobutanol  zapobiega dostępowi powietrza, który utrudnia proces polimeryzacji żelu (polimeryzacja trwa od 30 do 120 minut).  Po upływie czasu polimeryzacji, należy wypłukać izobutanol z góry żelu , po czym delikatnie osuszyć go bibułą, nie dopuszczając tym samym do przesuszenia górnej warstwy żelu. Następnie,  wylewa się żel górny ( 4% ), który jest tzw. żelem zagęszczającym ( w tym żelu umieszcza się grzebień  w celu powstania tzw. studzienek) [2], [3], [5], [9].

Przygotowanie żelu rozdzielającego i zagęszczającego [9].

W skłąd buforu do elektroforezy wchodzi Tris-glicyna o pH=8.3, żel rozdzielający zawiera Tris-HCl ( o pH=8.8), zaś żel zatężający Tris-HCl o niższym pH= 6.8 . Wyższe pH w żelu rozdzielającym powoduje jonizację glicyny, w związku zczym podczas rozdziału migruje ona tuż za jonami chlorkowymi [1].

Elektroforeza białek w żelu poliakryloamidowym (zawierającym SDS) [1].
Przygotowanie żelu:

Odczynniki: 
- mieszanina monomerów: akrylamid – bisakryloamid  (37,5 / 1) 30%
- 10% SDS
- 10% nadsiarczan amonu (APS)
- TEMED
- 1.5 M Tris o pH= 8.0
- 1M tris o pH= 6.8
- 5x stężony bufor do elektroforezy

Na początku należy przygotować odpowiednią ilość roztworu żelu rozdzielającego ( o odpowiedniej procentowości). Przygotowany roztwór  należy wlać pomiędzy dwie szklane płytki przedzielone przekładkami i połączone klamerkami, pozostawiając odpowiednią ilość miejsca, w celu późniejszego wylania żelu zatężającego, oraz włożenia grzebienia (studzienki w żelu) [1].

Po wylaniu, roztwór żelu trzeba bardzo ostrożnie zalać wodą lub alkoholem izoamylowym, i tak przygotowany  żel pozostawić do polimeryzacji (na ok. 30 minut). PO upływie czasu polimeryzacji,  zlać roztwór znad żelu, po czym żel przepłukać wodą (w celu usunięcia resztek nie spolimeryzowanego akryloamidu). Kolejnym krokiem jest przygotowanie roztworu żelu zatężającego. Roztwór ten należy bezpośrednio wylać na żel rozdzielający, a następnie (delikatnie) wsunąć grzebień- uważając by nie powstały pęcherzyki powietrza, które przeaszkadzają podczas rozdziału elektroforetycznego[1].

Ponownie pozostawić żel do polimeryzacji (ok. 30 minut). Gdy żel spolimeryzuje delikatnie usunąć grzebień i przepłukać kieszonki wodą dejonizowaną, żeby usunąć resztki niespolimeryzowanego akryloamidu (jak wyżej). 
Tak przygotowany żel poliakryloamidowymieścić umieścić w aparacie do elektroforezy i zalać 5x stężonym buforem do elektroforezy (tj.: 125mM Tris, 1.25M glicyna (pH 8.3), 0.5% SDS) [1].

Przygotowanie próbek do rozdziału elektroforetycznego:

Badane próbki należy zawiesić w buforze Leammeliego (tj.: 0.065M Tris-HCl, 2% SDS, 5% b -merkaptoetanol (pH 6.8), 0.01 % błękit bromofenolowy, 5% glicerol). Następnie, inkubować je przez 3 minuty w 100C w celu denaturacji białek. Po denaturacji próbki można nakładać na żel [1].


Warunki rozdziału elektroforetycznego:

Elektroforezę najlepiej prowadzić przy napięciu ok. 15 V na centymetr długości żelu  (do momentu, kiedy barwnik dojdzie do dolnej krawędzi żelu) [1].

Autor: Lidia Koperwas

Literatura:

[1]. Zakład Genetyki Uniwersytetu Warszawskiego, Genetyka molekularna- materiały do zajęć laboratoryjnych, Warszawa 2003. Skrypt przygotowany przez pracowników Zakładu Genetyki UW.s. 41-42]

[2].  Słomski R, 2008. Analiza DNA, teoria I praktyka. Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, Poznań 2008. s. 72-73]

[3]. Rickwood D., Hames B.D., 1982. Gel electrophoresis of nucleic acids: a practical approach. IRL. Press Limited, Oxford. 

[4]. Walkowiak B., Kochmańska V. Elektroforeza- przykłady zastosowań. Opracowanie zbiorowe. www.p.lodz.pl/biofizyka/elektroforeza.pdf

[5]. Westermeier R., 1993. Electrophoresis in practice. A guide to theory and practice. VCH Verlagsgeselschaft mbH, Weinheim. 

[6]. Hames D.B., Hooper N.M., 2009. Biochemia-krótkie wykłady. Wydawnictwo Naukowe PWN,  s.  68-71
[7]. http://microbio.gumed.edu.pl/materialy/biol_mol/Elektroforeza.pdf

[8]. http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=3423265

[9]. http://metlab.pl/Elektroforetyczny_rozdzial_bialek_p34.html





        


 






http://laboratoria.net/home/15600.html
Informacje dnia: Ograniczenie soli w diecie może być groźne Nie mam jeszcze wniosków na temat pochodzenia Covid-19 Najdokładniejsze systemy satelitarnego transferu czasu Ponad połowa chorych z SARS-CoV2 cierpi na długi covid Zintegrować informacje o logistyce Wystawa "Nie to niebo" Ograniczenie soli w diecie może być groźne Nie mam jeszcze wniosków na temat pochodzenia Covid-19 Najdokładniejsze systemy satelitarnego transferu czasu Ponad połowa chorych z SARS-CoV2 cierpi na długi covid Zintegrować informacje o logistyce Wystawa "Nie to niebo" Ograniczenie soli w diecie może być groźne Nie mam jeszcze wniosków na temat pochodzenia Covid-19 Najdokładniejsze systemy satelitarnego transferu czasu Ponad połowa chorych z SARS-CoV2 cierpi na długi covid Zintegrować informacje o logistyce Wystawa "Nie to niebo"

Partnerzy

GoldenLine Fundacja Kobiety Nauki Job24 Obywatele Nauki NeuroSkoki Portal MaterialyInzynierskie.pl Uni Gdansk MULTITRAIN I MULTITRAIN II Nauki przyrodnicze KOŁO INZYNIERÓW PB ICHF PAN FUNDACJA JWP NEURONAUKA Mlodym Okiem Polski Instytut Rozwoju Biznesu Analityka Nauka w Polsce CITTRU - Centrum Innowacji, Transferu Technologii i Rozwoju Uniwersytetu Akademia PAN Chemia i Biznes Farmacom Świat Chemii Forum Akademickie Biotechnologia     Bioszkolenia Geodezja Instytut Lotnictwa EuroLab

Szanowny Czytelniku!

 
25 maja 2018 roku zacznie obowiązywać Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2016/679 z dnia 27 kwietnia 2016 r (RODO). Potrzebujemy Twojej zgody na przetwarzanie Twoich danych osobowych przechowywanych w plikach cookies. Poniżej znajdziesz pełny zakres informacji na ten temat.
 
Zgadzam się na przechowywanie na urządzeniu, z którego korzystam tzw. plików cookies oraz na przetwarzanie moich danych osobowych pozostawianych w czasie korzystania przeze mnie ze strony internetowej Laboratoria.net w celach marketingowych, w tym na profilowanie i w celach analitycznych.

Kto będzie administratorem Twoich danych?

Administratorami Twoich danych będziemy my: Portal Laboratoria.net z siedzibą w Krakowie (Grupa INTS ul. Czerwone Maki 55/25 30-392 Kraków).

O jakich danych mówimy?

Chodzi o dane osobowe, które są zbierane w ramach korzystania przez Ciebie z naszych usług w tym zapisywanych w plikach cookies.

Dlaczego chcemy przetwarzać Twoje dane?

Przetwarzamy te dane w celach opisanych w polityce prywatności, między innymi aby:

Komu możemy przekazać dane?

Zgodnie z obowiązującym prawem Twoje dane możemy przekazywać podmiotom przetwarzającym je na nasze zlecenie, np. agencjom marketingowym, podwykonawcom naszych usług oraz podmiotom uprawnionym do uzyskania danych na podstawie obowiązującego prawa np. sądom lub organom ścigania – oczywiście tylko gdy wystąpią z żądaniem w oparciu o stosowną podstawę prawną.

Jakie masz prawa w stosunku do Twoich danych?

Masz między innymi prawo do żądania dostępu do danych, sprostowania, usunięcia lub ograniczenia ich przetwarzania. Możesz także wycofać zgodę na przetwarzanie danych osobowych, zgłosić sprzeciw oraz skorzystać z innych praw.

Jakie są podstawy prawne przetwarzania Twoich danych?

Każde przetwarzanie Twoich danych musi być oparte na właściwej, zgodnej z obowiązującymi przepisami, podstawie prawnej. Podstawą prawną przetwarzania Twoich danych w celu świadczenia usług, w tym dopasowywania ich do Twoich zainteresowań, analizowania ich i udoskonalania oraz zapewniania ich bezpieczeństwa jest niezbędność do wykonania umów o ich świadczenie (tymi umowami są zazwyczaj regulaminy lub podobne dokumenty dostępne w usługach, z których korzystasz). Taką podstawą prawną dla pomiarów statystycznych i marketingu własnego administratorów jest tzw. uzasadniony interes administratora. Przetwarzanie Twoich danych w celach marketingowych podmiotów trzecich będzie odbywać się na podstawie Twojej dobrowolnej zgody.

Dlatego też proszę zaznacz przycisk "zgadzam się" jeżeli zgadzasz się na przetwarzanie Twoich danych osobowych zbieranych w ramach korzystania przez ze mnie z portalu *Laboratoria.net, udostępnianych zarówno w wersji "desktop", jak i "mobile", w tym także zbieranych w tzw. plikach cookies. Wyrażenie zgody jest dobrowolne i możesz ją w dowolnym momencie wycofać.
 
Więcej w naszej POLITYCE PRYWATNOŚCI
 

Newsletter

Zawsze aktualne informacje