Oznaczanie cholesterolu i innych związków nierozpuszczalnych w wodzie

Związki nierozpuszczalne w wodzie to grupa bardzo licznych związków chemicznych o najróżniejszej budowie. Mimo to, właściwości charakterystyczne tych związków pozwalają przeprowadzić ich analizę jakościową i ilościową w badanych próbkach.

Jednym z najważniejszych, biologicznie czynnych związków nierozpuszczalnych w wodzie jest cholesterol, który jest przedstawicielem steroli zwierzęcych. Jest syntetyzowany przez większość narządów, jednak najobficiej powstaje w wątrobie i w ścianie jelit. Dominuje w błonach komórkowych i lipoproteinachosocza krwi. Cholesterol, dzięki obecności wiązania podwójnego, w obecności mocnych kwasów tworzy barwne produkty (próba Salkowskiego oraz Liebermana-Burcharda).

Wprowadzenie

Do związków nierozpuszczalnych w wodzie zalicza się lipidy, woski, tłuszcze właściwe oraz tłuszcze złożone oraz sterole. Związki te posiadają w swojej budowie glicerol i wyższe kwasy tłuszczowe lub sterole. Do grupy tych związków zalicza się wiele różnorodnych struktur chemicznych, których cechą charakterystyczną jest hydrofobowość i niepolarność cząsteczki. Najbardziej znanym związkiem nierozpuszczalnym w wodzie jest cholesterol należący do grupy związków zwanych sterolami [1].

Sterole

W skład wszystkich steroli wchodzi układ czteropierścieniowy, zwany układem steroidowym.

Rysunek 1. Układ steroidowy

Powstają poprzez formalne podstawienie atomu węgla w pozycji 3 w szkielecie steroidu przez grupę hydroksylową. Sterole to zróżnicowana klasa związków i poza szkieletem węglowym przedstawianym powyżej (Rysunek 1) dla wszystkich steroidów (nazwa systematyczna szkieletu to: 1,2-cyklopentanoperhydrofenantrenu) oraz grupy hydroksylowej w pozycji 3 nie można u nich wyróżnić wspólnych cech. Najczęściej grupa hydroksylowa oprócz w pozycji 3 występuje w pozycji 17 steroidu [2].

Tabela 1. Podział steroli ze względu na pochodzenie

Do najważniejszych steroli zwierzęcych należy cholesterol, będący istotnym składnikiem lipoprotein, błon komórkowych oraz prekursorem większości związków sterydowych występujących w organizmie, takich jak kwasy żółciowe i hormony sterydowe: androgeny, estrogeny, progesterony czy kortykoidy. Pewna część cholesterolu wchodzącego w skład błon biologicznych występuje w formie estrów z kwasami tłuszczowymi. Innym ważnym ale mniej znanym sterolem jest ergosterol, będący prekursorem witaminy D2 oraz 7- dehydrocholesterol – prekursor witaminy D3.

Cholesterol

Cholesterol (dawna nazwa to cholesteryna) związek nierozpuszczalny w wodzie, jak już wspomniano należy do steroidów alkoholowych (posiada jedną grupę hydroksylową [1, 3]. Jak w przypadku innych steroidów, cząsteczka cholesterolu posiada 3 pierścienie sześciowęglowe (cykloheksanowe, jeden z nich zawiera też wiązanie podwójne) i czwarty pięciowęglowy (cyklopentanowy) - Rysunek 2.

Rysunek 2. Cząsteczka cholesterolu

Oznacza się je kolejnymi literami alfabetu łacińskiego odpowiednio A, B i C oraz D. Pierścienie sześciowęglowe, przedstawiane na rysunkach zazwyczaj w postaci sześciokąta foremnego, w rzeczywistości przyjmują konformację krzesłową.

Rysunek 3. Struktura przestrzenna pierścieni cholesterolu; A - układ steroidowy – numeracja węgli i oznaczenie pierścieni; B i C - najczęściej występujące struktury przestrzenne układu steroidowego

Niesie to za sobą pewne konsekwencje. Podstawniki w pierścieniu cykloheksanowego mogą być ułożone:
a. ekwatorialnie (6 podstawników),
b. aksjalnie (6 podstawnikówo dużym zagęszczeniu elektronowym)

Konformacja ta sprawia, że sąsiadujące pierścienie leżą zwykle aksjalnie oraz w położeniu trans względem siebie [3]. Grupy metylowe ułożone aksjalnie w położeniu β, zaś grupa hydroksylowa znajduje się w położeniu ekwatorialnym. Cząsteczka ta posiada osiem węgli chiralnych (C3, C8, C9, C10, C13, C14, C17, C20), czyli może posiadać aż 256 izomerów optycznych (wyliczenie z wzoru 2ⁿ, gdzie n – to liczba atomów chiralnych). Z czego 128 par enancjomerów. Ze względu, iż atomy te wchodzą w strukturę pierścieni, co wywołuje naprężenia steryczne w przyrodzie nie występuje aż tyle izomerów optycznych cholesterolu [3].

Cholesterol, jak i jego pochodne znajdują się w tratwach lipidowych błon komórkowych komórek zwierzęcych [4]. Pełni bardzo ważne funkcje w organizmie [5, 6]. Stanowi substrat do syntezy hormonów płciowych, witamin oraz kwasów żółciowych. Potocznie cholesterolem nazywa się obecne w osoczu krwi pokrewne substancje lipidowe – lipoproteiny, w skład których między innymi wchodzi też cholesterol. Cholesterol dostaję się do organizmu drogą pokarmową, jak i biosyntezy de novo [2, 7]. Kumuluje się w tkankach i osoczu krwi, jego nadmiar jest przyczyna niewydolności układu krążenia.

Reakcje związków nierozpuszczalnych w wodzie [2, 8]

Do reakcji charakterystycznych dla związków nierozpuszczalnych w wodzie specyficzne są reakcje dla lipidów. Do reakcji tych zaliczamy:

Wykrywanie gliceryny – jest to reakcja specyficzna organoleptyczna; przeprowadza się ją w środowisku słabo kwaśnym lub obojętnym, podczas ogrzewania, glicerydy ulegają rozpadowi z wytworzeniem lotnego aldehydu – akroleiny, o charakterystycznym zapachu; należy pamiętać, iż akroleina jest karcinogenna.
Zmydlanie tłuszczów – reakcja oparta na hydrolizie alkalicznej lipidów, w skutek, której powstaje gliceryna i sole wyższych kwasów tłuszczowych, czyli mydła. Reakcja ta polega na tworzeniu mydeł i wyznaczaniu tzw. liczby zmydlania, tj. liczby miligramów wodorotlenku potasu zobojętniającej kwasy tłuszczowe zawarte w 1g badanego tłuszczu. Właściwości mydeł bywają różne w zależności od metalu tworzącego sól: mydła będące solami litowców są rozpuszczalne w wodzie ale w reakcji z solami metali dwu- i trójwartościowych tworzą, na skutek wymiany, sole nierozpuszczalne. Mydła należą do związków powierzchniowo czynnych, tworzących koloidy
Wykrywanie wiązań podwójnych w związkach nierozpuszczalnych w wodzie

Obecność wiązań wielokrotnych C=C w związkach nierozpuszczalnych w wodzie jest związane z występowaniem w strukturze kwasów tłuszczowych. Zatem lipidy dają odczyn charakterystyczny dla związków nienasyconych:

reakcja z roztworem nadmanganianu potasu – jest to reakcja kolorymetryczna; następuje zmiana barwy z purpurowej na bezbarwną w wyniku reakcji jonów MnO4 dochodzi do utlenienia wiązania podwójnego, w wyniku czego powstaje alkohol dwuhydroksylowy (B) lub następuje rozerwanie cząsteczki, czego rezultatem jest powstanie dwóch cząsteczek aldehydu (A).

odczyn Hübla – reakcja również kolorymetryczna, polegająca także na odbarwieniu roztworu; w reakcji z jodem dochodzi do addycji cząsteczki jodu do wiązania podwójnego, co prowadzi do powstania dijodopochodnej oraz powoduje odbarwienie roztworu jodu.

Reakcje oznaczania cholesterolu

a. Odczyn Salkowskiego – pod wpływem stężonego kwasu siarkowego tworzą się produkty kondensacji, dehydratacji i sulfonowania cholesterolu. Powstałe produkty są intensywnie zabarwione, co umożliwia identyfikacje i oznaczanie ilościowe tego sterolu. Zmiana barwy jest spowodowana reakcją eliminacji dwóch cząsteczek wody i powstania czerwonego kwasu disulfonowego bicholestadien.

b. Odczyn Liebermanna-Burcharda - natomiast w obecności kwasu siarkowego i bezwodnika kwasu octowego tworzy się kwas monosulfonowy bicholestadienu
c. Reakcja cholesterolu z bromem

Tabela 2. Wykonanie doświadczeń do oznaczania cholesterolu

Podsumowanie

Przedstawicielem związków nierozpuszczalnych w wodzie jest cholesterol. Podobnie jak inne związki tej grupy rozpuszcza się w eterze, benzenie i innych rozpuszczalnikach organicznych. Sterole zawierające podwójne wiązanie w reakcji z mocnymi kwasami dają barwne produkty. Ślady wody uniemożliwiają te reakcje. Reakcje charakterystyczne dla cholesterolu należą do reakcji barwnych kolorymetrycznych, ponieważ powstałe pochodne sulfonowe tego związku są barwne: zielone w reakcji Liebermana-Burcharda i czerwone w reakcji Salkowskiego.

Autor: Lidia Koperwas

Literatura

[1] Jeremy M. Berg, Lubert Stryer, John L. Tymoczko. Biochemia. 2011. PWN
[2] Błażej Gierczyk, Grzegorz Schroeder. Fizykochemiczne podstawy życia. 2001. Uniwerystet im. Adama Mickiewicza. Poznań
[3] John McMurry: Chemia organiczna. Wyd. 4. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2000
[4] Grądzka I, Sochanowicz B, Brzóska K, Wójciuk G, Sommer S, Wojewódzka M, Gasińska A, Degen C, Jahreis G, Szumiel I.Cis-9,trans-11-conjugated linoleic acid affects lipid raft composition and sensitizes human colorectal adenocarcinoma HT-29 cells to X-radiation. Biochim Biophys Acta. 2013
[5] Smith LL. Another cholesterol hypothesis: cholesterol as antioxidant. Free radical biology & medicine. 1 (11), s. 47–61, 1991.
[6] Haines TH. Do sterols reduce proton and sodium leaks through lipid bilayers? Progress in lipid research. 4 (40), s. 299–324, 2001
[7]Kathleem M. Botham, Peter A. Mayes: Synteza, transport i wydzielanie cholesterolu. W: Robert K Murray, Daryl K Granner, Victor William Rodwell, Franciszek Kokot, Zenon Aleksandrowicz, Harold A Harper: Biochemia Harpera ilustrowana. Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2008, s. 282-285.
[8]Robert T. Morrison, Robert N. Boyd. Chemia organiczna. 2012. PWN