- Biochemia
- Biofizyka
- Biologia
- Biologia molekularna
- Biotechnologia
- Chemia
- Chemia analityczna
- Chemia nieorganiczna
- Chemia fizyczna
- Chemia organiczna
- Diagnostyka medyczna
- Ekologia
- Farmakologia
- Fizyka
- Inżynieria środowiskowa
- Medycyna
- Mikrobiologia
- Technologia chemiczna
- Zarządzanie projektami
- Badania kliniczne i przedkliniczne
Metody wykorzystywane do oznaczania żelaza w różnych próbkach biologicznych
W celu odczytania wyników przeprowadzonego oznaczenia należy wykonać krzywą wzorcową :
a) roztwór podstawowy (0,3510 g FeS0 4(NH4)2SO4• 6H2O rozpuszcza się w wodzie destylowanej uzupełniając do objętości 500 ml (1 ml tak sporządzonego roztworu zawiera 100 ɣ Fe2+)
b) roztwory wzorcowe: ze świeżo przygotowanego roztworu podstawowego odmierza się po: 5, 10, 15 i 20 ml do kolb miarowych na 100 ml dodając 10 ml 25% kwasu siarkowego i uzupełniając wodą destylowaną do kreski. Z roztworów tych pobiera się kolejno po 5 ml, co odpowiada 25, 50, 75 i 100 ɣ Fe2+ do kalibrowanych probówek na 25 ml i dalej postępuje się tak, jak z badaną próbą [2].
W metodach oznaczania zawartości żelaza z rodankiem potasu wymienia się kilka najważniejszych czynników, które mają wpływ na dokładność metody:
- odczyn badanego roztworu
- stężenie odczynnika reagującego oraz jego czułość w danej metodzie
- szybkość powstawania oraz trwałość barwnego kompleksu w roztworze
- rodzaj reduktora
- odczyn środowiska, który nie uregulowany może powodować podwyższenie lub obniżenie wyników oznaczeń [2].
Oznaczanie Fe(II) metodą 1,10-fenantrolinową z wykorzystaniem spektrofotometrii UV-VIS
W trakcie oznaczania żelaza powyższą metodą dochodzi do redukcji żelaza Fe3+ do Fe2+. Po redukcji żelazo przeprowadza się w kompleks z 1,10-fenantroliną. Intensywność powstałego w próbce pomarańczowego zabarwienia jest proporcjonalna do zawartości żelaza. Zawartość żelaza oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali równej λ= 510 nm [4].
Wykonanie oznaczenia:
Należy przygotować 6 starannie umytych kolb miarowych o pojemności 50 cm3, do których kolejno należy odmierzyć: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 oraz 2,5 ml wzorcowego roztworu soli żelaza (II) o stężeniu 50 ppm. Do każdej kolby dodać 2 cm3 10 % roztworu chlorowodorku hydroksyloaminy oraz 5 cm3 10% cytrynianu sodu. Odczekać chwilę, po czym do próbek dodać 5 cm3 roztworu 1,10-fenantroliny (tj.: 0,25% roztwór 1,10-fenantroliny w 0,1M HCl). Zawartość kolbek uzupełnić wodą destylowaną do kreski i dokładnie wymieszać. Próbki inkubować przez 10 minut, a następnie zmierzyć absorbancję roztworu przy długości fali równej λ= 500 nm [4].
Oznaczanie żelaza metodą Ramsaya z α,α’-dipirydylem (wg Homolka J., 1961)
Dwuwartościowe żelazo (z dodatkiem Na2SO3) w wyniku reakcji z α,α’-dipirydylem daje różowy kompleks. Wykorzystywaną do oznaczenia surowicę należy odbiałczyć (metodą na gorąco po zakwaszeniu kwasem octowym). Wytrącone białko poddaje się wytrząsaniu z chloroformem, a następnie odwirowuje [1].
Odczynniki:
1)Roztwór wzorcowy żelaza: 0,863 g 12∙hydratu siarczanu (VI) amonu i żelaza (III) (siarczanu żelazowo-amonowego), NH4Fe(SO4)2 ∙12 H2O lub 0,702 g 6∙ hydratu siarczanu (VI) amonu i żelaza(II) (siarczanu żelazowo-amonowego, soli Mohra)-(NH4)2Fe(SO4)2∙6H2O rozpuścić w wodzie, a następnie dodać 10 ml stężonego roztworu kwasu siarkowego (VI). Całość uzupełnić wodą do objętości 1000 ml. Przygotowany w ten sposób 1 ml roztworu zawiera 0,1 mg (100 µg) żelaza [1].
2)Roztwór wzorcowy (rozcieńczony): roztwór wzorcowy należy rozcieńczyć 100x w kolbie miarowej (1 ml rozcieńczonego roztworu zawiera 1 µg Fe) [1].
Wykonanie:
Do probówki wirówkowej odmierzyć 2 ml niezhemolizowanej surowicy wraz z dodatkiem 2 ml 0,1M roztworu Na2SO3 (tj.: Na2SO3 ∙7H2O)oraz 2 ml 0,1% roztworu α,α’-dipirydylu ( w 3% roztworze CH3COOH). Równolegle należy wykonać oznaczenie próby kontrolnej i wzorcowej, gdzie zamiast surowicy do próbek dodawana jest woda lub wzorzec.
Przygotowane w powyższy sposób 3 probówki należy dokłzdnie wymieszać za pomocą bagietki, a następnie wstawić do łaźni wodnej (wrzącej) na 5-minutową inkubację. Probówkę z próbą badaną ostudzić pod bieżącą wodą, po czym dodać do niej 2 ml chloroformu. Probówkę zamknąć korkiem i wytrząsać przez 30 sekund, a dalej odwirować, w ten sposób by zabarwiona warstwa była klarowna (bez najmniejszego śladu zmętnienia). Otrzymaną klarowną warstwę przenieść do nowej probówki chemicznej i oznaczyć wartość absorbancji próby badanej i wzorcowej wobec próby kontrolnej. Oznaczenie wykonać przy λ= 522 nm, w kuwetach o możliwie największej grubości warstwy [1].
Opierając się na otrzymanych wynikach wykonać obliczenie:
µg/100 ml= (A(absorbancja) roztworu badanego/ A(absorbancja)wzorca x 100[1]
Oznaczanie żelaza w surowicy z o-fenantroliną (wg Krawczyński J., Osiński T., 1967)
Dwuwartościowe żelazo utrzymane w tej postaci obecnością hydroksylaminy, w reakcji z o-fenantroliną daje różowy kompleks (wymagane lekko kwasowe pH). Surowicę wykorzystywaną do oznaczenia należy odbiałczyć na gorąco w pH=4,4, a wytrącone białko oddzielić przez wytrząsanie z czterochlorkiem węgla i ponowne odwirowanie [1].
Tagi: żelazo, surowica, metoda rodankowa, spektrofotometria, roztwór wzorcowy, rodanek potasu, metodą 1, 10-fenantrolinowa, metoda Ramsaya, α, α’-dipirydyl, o-fenantrolina, peptyd hepcydyna, TSH, niedoczynność żelaza
wstecz
Podziel się ze znajomymi
Recenzje