Izolacja oraz analiza wybranych parametrów płytek krwi cz. 2

Liofilizacja płytek krwi

W 1950 roku liofilizacja uznawana była za jedną z metod preparatyki płytek krwi. W wyniku zakrojonych badań wykazano, że najbardziej efektywna jest liofilizacja z zastosowaniem 1,8% paraformaldehydu z 5% albuminą. Dzięki temu nawodnione płytki krwi mają podobny wygląd do świeżych płytek, a także zachowana zostaje większość ich białek powierzchniowych. Liofilizacja zapewnia długą trwałość próbek [13].

Błona komórkowa płytki krwi stabilizowana jest za pomocą cytoszkieletu, a w jej skład wchodzą liczne glikoproteiny receptorowe, które sprzężone są z enzymatycznymi łańcuchami przekazywania sygnałów [2]. W trakcie aktywacji płytek krwi dochodzi do zmian w cytoszkielecie w wyniku, czego gładkie i owalne komórki przekształcają się w okrągłe z pseudopodiami. Z ziarnistości zostają uwalniane substancje, co z kolei prowadzi do końcowego oraz nieodwracalnego etapu ich aktywacji, czyli agregacji płytek. Zachodząca degranulacja ziarnistości płytek przyczynia się do uwalniania agonistów płytek (m.in. ADP, PAF) w wyniku, czego dochodzi do aktywacji kolejnych płytek w miejscu urazu bądź infekcji bakteryjnej [14].

Otrzymywanie frakcji cytoszkieletu z płytek krwi (frakcja nierozpuszczalna w Tritonie X-100, wg Fujimura i wsp., 1990)

Wykonanie:

Do 1 ml zawiesiny płytek krwi (płytki krwi otrzymane metodą wirowania osocza bogatopłytkowego, zawieszone w buforze Tyroda) należy dodać 0,1 ml roztworu trombiny (400 j. NIH/ml) do końcowego stężenia równego 1 j. NIH/ml). Przygotowaną w ten sposób próbkę należy poddać inkubacji w 37⁰C przez 2 minuty, po czym zatrzymać reakcję przez dodanie do próbki 1,1 ml 10 mM roztworu DIFP (diisopropyl fluorophosphate).

W kolejnym etapie do badanej próbki dodać równą objętość buforu o pH 7,4 (tj. 100 mM Tris/HCl – 2% Triton X-100 – 4 mM EDTA). Próbkę odstawić na około 15-20 minut, a następnie odwirować przy 5 000 obr./min przez 5 minut. Otrzymany osad (frakcja nierozpuszczalna w Tritonie) przemyć 2- krotnie: pierwsze przepłukanie wykonać za pomocą rozcieńczonego w stosunku 1:1 buforu o pH= 7,4 (bufor rozcieńczyć 0,9% NaCl), a drugie przepłukanie osadu wykonać samym 0,9% roztworem NaCl.

Otrzymaną frakcję białek cytoszkieletu rozpuścić w roztworze składającym się z 2% SDS oraz 8 M mocznika. Białka należy analizować podczas elektroforetycznego rozdziału w żelu poliakrylamidowym (elektroforezę przeprowadzić w 8% i 12% żelu z SDS wg metody Laemmliego).

W celu otrzymania preparatów zredukowanych, do próbek należy dodać β-merkaptoetanol (do końcowego stężenia 1,4%) i ogrzewać w temp. 100⁰C przez 5 minut. Wybarwienie żeli wykonać za pomocą błękitu Coomassie Brilliant Blue G-250 [2].

Autor: Zuzanna Koperwas

LITERATURA:

[1]. Rywaniak J., Luzak B., Watała C., 2012. Wykorzystanie metody cytometrii przepływowej do oceny żywotności płytek krwi barwionych kalceiną. diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2012 • Volume 48 • Number 3 • 279-285. http://www.researchgate.net/publication/247151371_Wykorzystanie_metody_cytometrii_przepywowej_do_oceny_ywotnoci_pytek_krwi_barwionych_kalcein

[2]. Kłyszejko-Stefanowicz L, 2003. Ćwiczenia z biochemii. Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003, s.665-671

[3]. Josic D., Hoffer L., Buchacher A., Frenzel W. i wsp.,2000. Manufacturing of a prothrombin complex concentrate aiming at low thrombogenicity. Thrombosis Research 2000; 100: 433–441.

[4]. Levy H.J., Szlam F., Tanaka K.A. i wsp.,2012. Fibrynogen and Hemoostasis: A Primary

Hemostatic Target for the Management of Acquired Bleeding. Anesthesia Analgesia 2012; 114: 261–274.http://www.wim.mil.pl/images/stories/Wydawnictwa/Wytyczne_internet_aktywny_spis_treci.pdf

[5]. Wrzyszcz A.,2003. Matrix Metalloproteinases of Platelets. Adv. Clin. Exp. Med. 2003,

12, 6, 833–839. http://www.dbc.wroc.pl/Content/2351/R19-Wrzy.pdf
[6]. Fluo Cell Double Staining Kit (Calcein AM / PI), http://abo.com.pl/pl/p/Fluo-Cell-Double-Staining-Kit-Calcein-AM-PI/15067

[7]. Niemirowicz K., Żelazowska-Rutkowska B., Wysocka J., Car H., 2012. Platelet number disorders. diagnostyka laboratoryjna, Journal of Laboratory Diagnostics 2012 • Volume 48 • Number 4 • 455-460
[8].http://edraurban.pl:8080/book-sample-file/diagnostyka-laboratoryjna-w-weterynarii/pdf/093_110_r06_veterinarylabmed.pdf
[9]. Italiano J.E. Jr. The structure and production of blood platelets. Chapter 1. http://assets.cambridge.org/97805218/81159/excerpt/9780521881159_excerpt.pdf

[10]. Harrison P., 2005. Platelet functions analysis. Blood Reviews (2005) 19, 111–123. Oxford Haemophilia Centre & Thrombosis Unit, Churchill Hospital, Oxford OX3 7LJ, UK. http://www.uv.es/bacete/Histologia/Plaquetas_funcion.pdf

[11]. Bambace N.M., Holmes C.E., 2011. The platelet contribution to cancer progression. Journal of Thrombosis and Haemostasis ,9: 237–2. http://med.uvm.edu/lcbr/Downloads%5Cplatelets.pdf

[12]. Komosa A., 2013. Rozprawa doktorska. Ocena wartości prognostycznej wybranych parametrów klinicznych (Predict Score) oraz testu oporności płytek krwi na klopidogrel (Multiplate) w przewidywaniu zdarzeŃ niedokrwiennych u pacjentów po zabiegach przezskórnej interwencji wieńcowej. http://www.wbc.poznan.pl/Content/298663/index.pdf

[13]. http://biomed.brown.edu/Courses/BI108/BI108_2005_Groups/10/webpages/plateletslink.htm

[14]. Smorąg I., Baj Z., 2007. Niehemostatyczna rola płytek krwi. Zakład Patofizjologii i Immunologii Klinicznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. http://www.diagnostykalaboratoryjna.eu/journal/DL_2008__2;_241-248.pdf

[15]. Saluk J., Bijak M., Ponczek M.B., Wachowicz B., 2014. Powstawanie, metabolizm i ewolucja płytek krwi. Postępy Hig Med Dosw (online), 2014; 68: 384-391

[16]. Immunologiczne zasady przetaczania koncentratów krwinek płytkowych (KKP). Rozdział 1. http://bip.rckik.radom.pl/wp-content/uploads/2014/09/Immunologiczne-Zasady-Przetaczania-KKP.pdf

[17]. Maślanka K., 2011. Współczesne poglądy na występowanie oporności na przetaczanie koncentratów krwinek płytkowych. Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 3, str. 453–465
[18].. AatonenM.T, ÖhmanT., NymanT.A., LaitinenS., GrönholmM., SiljanderP.R.-M., 2014. Isolation and characterization of platelet-derived extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles, Vol 3 (2014) incl supplements. http://www.journalofextracellularvesicles.net/index.php/jev/article/view/24692#F0001_24692

[19]. FRASER MUSTARD J., KINLOUGH-RATHBONE R.L., PACKHAM M.A.,1989. Isolation of Human Platelets from Plasma by Centrifugation and Washing. Methods in enzymology, Vol 169. http://ncxt.lbl.gov/files/paper/other_paper/platelet-isolation.pdf

[20]. http://www.abcam.com/protocols/isolation-of-human-platelets-from-whole-blood

[21]. Mustard J.F., Kinlough-Rathbone R.L., Packham M.A., 1989. Isolation of Human Platelets from Plasma by Centrifugation and Washing. Methods in Enzymology, VOL 169, http://ncxt.lbl.gov/files/paper/other_paper/platelet-isolation.pdf