Wykorzystanie chromatografii powinowactwa do izolowania fibrynogenu (Heene D.L. i wsp., 1979)

Chromatografia powinowactwa (ang. affinity chromatography) to rodzaj chromatografii adsorpcyjnej, gdzie wykorzystywane jest wzajemne powinowactwo dwóch substancji (np. enzymu i inhibitora). Zastosowanie chromatografii powinowactwa pozwala na znaczne skrócenie, a zarazem uproszczenie metodyki izolowania wybranej substancji (np. białka). Jednocześnie technika ta pozwala na zachowanie biologicznej aktywności izolowanej substancji [2]. Wśród wykorzystywanych w tej technice złóż najczęściej wybiera się złoża mające również zastosowanie w  filtracji żelowej (złoża wymagają odpowiedniej aktywacji) . Wśród dostępnych złóż znajdują się również takie, które nie wymagają wcześniejszego przygotowywania (są one przystosowane do chemicznego wiązania liganda np.złoże CNBr-Sepharose 4B) [2].

Zasada metody

Fibrynogen świni  (otrzymany metodą Doolittle’a) wiązany jest kowalencyjnie do wolnych grup aminowych z żelem (CNBr-Sepharose). W kolejnym etapie metody fibrynogen pod wpływem trombiny przekształcany jest do  monomerów fibryny. Uzyskane tą metodą złoże [Fibrin(Fb)-Sepharose 4B] wykazuje powinowactwo do fibrynogenu. Metoda wykorzystywana jest do izolowania białka z małych próbek osocza, a także do izolacji jego produktów, powstających w trakcie plazminowej degradacji np. fragmentów X,Y i D.

Wykonanie:

W celu przygotowania złoża należy odważyć 5g CNBr-Sepharose 4B, wsypać do 100 ml 1 mM roztworu HCl, a następnie pozostawić na 15 minut w celu napęcznienia. Otrzymany w ten sposób żel przemyć za pomocą 1 mM roztworu HCl (5-krotne przemycie żelu 900 ml roztworu) oraz 2-krotnie buforem boranowym (pH=8.3). Do ok. 20-25 ml zawiesiny należy odmierzyć 20 ml roztworu fibrynogenu o znanym stężeniu (tj. 10-15 mg/ml w 0,1 M buforze boranowym o pH=8.3). Następnie sprawdzić pH roztworu, które powinno wynosić powyżej 8.0. Całość delikatnie wymieszać i pozostawić w temperaturze 4°C  na ok. 12 godzin, po czym zawiesinę należy odwirować przy 500 obr./min (5 minut). Po wirowaniu zmierzyć objętość otrzymanego supernatantu, po czym oznaczyć w nim stężenie fibrynogenu (w tym celu można wykorzystać metodę spektrofotometryczną).

Na podstawie otrzymanych wyników można określić jaka ilość białka uległa związaniu ze złożem CNBr-Sepharose 4B. 

Otrzymany żel przemyć kolejno (ok. 30-ml porcjami):

a) 3-krotnie 0,1 M buforu octanowego o pH=4.0 (tj.: 5,85 g NaCl oraz 0,82 g CH₃COONa należy rozpuścić w ok. 90 ml wody, doprowadzić do odpowiedniego pH za pomocą lodowatego CH₃COOH, po czym uzupełnić wodą do objętości 100 ml).

b) wodą

c) 2-krotnie buforem PBS (tj.: 0,01 M bufor fosforanowy- 0,14 M NaCl (pH=7.4)).

Otrzymywanie Fb-Sepharose 4B:

Do żelu z kowalencyjnie przyłączonym fibrynogenem (Fb-Sepharose 4B) należy dodać  roztwór trombiny w ilości 0,5 j.NIH/mg związanego białka. Mieszaninę pozostawić na 12 godzin w temperaturze 4°C, po czym przemyć 250 ml roztworu PBS. Do otrzymanego żelu dodać NaN₃(1 mg/ml) wraz z dodatkiem kropli toluenu (złoże przechowywać w temperaturze 4°C) [1].

Izolowanie fibrynogenu z osocza krwi

Złoże Fb-Sepharose (10 ml) należy przemyć 2x buforem PBS, po czym odwirować przy 500 obr./min (5 minut). Następnie do żelu dodać ok. 20-50 ml osocza krwi, a całość dokładnie wymieszać na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej (mieszanie prowadzić przez 1 minutę). Po jego zakończeniu  otrzymane osocze z żelem należy przenieść na kolumnę chromatograficzną (o wymiarach 2x30 cm). Nieswoiście zaadsorbowane białka plazmy należy odmyć (aż do absorbancji A_280nm= 0), stosując w tym celu mieszaninę: 0,01 M NaH₂PO₄- 1 M NaCl (pH=4.1). Specyficznie związany ze złożem fibrynogen odmywa się z kolei stosując mieszaninę: 0,01 M NaH₂PO₄ – 1M NaCl-6 M mocznik (pH=4.1). W trakcie odmywania fibrynogenu zbiera się 2 ml frakcje, które następnie oznaczane są spektrofotometrycznie (pomiar absorbancji frakcji przy λ=280 nm). Obecny w mieszaninie mocznik usunąć przez dializę wobec dużej ilości buforu PBS (dializę prowadzić w 4°C przez noc). Stężenie otrzymanego roztworu fibrynogenu oznacza się spektrofotometrycznie, używając w tym celu współczynnika absorpcji (A^1%_{280 nm} = 15,5), po czym przeprowadza się analizę elektroforetyczną w żelu poliakrylamidowym z 0,1% SDS w warunkach redukujących oraz nieredukujących [1].

Wśród najczęściej oznaczanych wskaźników krzepnięcia krwi, pozwalających określić stan układu krzepnięcia wymienia się:

- czas protrombinowy lub czas tromboplastynowy (PT)- wskazuje na zdolność przemiany fibrynogenu w fibrynę. Wskaźnik ten nie jest zależny od zewnątrz- i wewnątrzpochodnego układu aktywacji protrombiny [3]. Zależy od zawartości w osoczu protrombiny oraz czynników V, VII i X, a także fibrynogenu. Określanie PT jest z badaniem z wyboru, służącym do monitorowania terapii przeciwzakrzepowej antagonistami witaminy K. Zakres wartości prawidłowych przy oznaczaniu PT mieści się w granicach 11-14 s i zależą one od aktywności stosowanej w oznaczeniu tromboplastyny [4]. Rola witaminy K polega na udziale w procesach syntezy części czynników układu krzepnięcia krwi, a jej działanie polega na umożliwieniu przekształcenia kwasu glutaminowego do kwasu ɣ-karboksyloglutaminowego. Proces ten jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania czynników krzepnięcia krwi. Antagoniści witaminy K działają z opóźnieniem (zazwyczaj 2-4 dni), a swoją budową przypominają samą wit.K. Przypuszcza się, że ich działanie polega na blokowaniu receptorów, które odpowiedzialne są za jej wiązanie [5].

- czas aktywowanej tromboplastyny częściowej (APTT) tzw. czas kaolinowo-kefalonowy jest miarą sprawności wewnątrzpochodnego układu aktywacji protrombiny [3].  Wskaźnik ten jest miarą wewnątrzpochodnego układu aktywacji protrombiny, która zachodzi po maksymalnej aktywacji czynników XI i XII. Czas ten zależy od zawartości w osoczu czynników II, V, VIII, IX, X, IX , XII oraz fibrynogenu. Nie jest z kolei zależny od liczby krwinek płytkowych. Prawidłowe wartości APTT po aktywacji zazwyczaj mieszczą się w granicach 28 – 34 s. Przedłużony czas częściowej tromboplastyny po aktywacji zachodzącej przy nieobecności heparyny wskazuje na niedobór jednego z czynników krzepnięcia (tj. hemofilie typu A,B, czy chorobę von Willebranda). Może być również skutkiem pojawienia się w krążeniu krążących antykoagulantów lub przeciwciał skierowanych przeciwko czynnikom krzepnięcia [4].