W metodach wykorzystywanych do określania stopnia krzepliwości fibrynogenu związek ten występując w roztworze ulega przekształceniu we włóknik. Proces  zachodzi pod wpływem działania enzymu trombiny, a stosunek ilości wykrzepionego włóknika do białka całkowitego występującego w preparacie (wyrażony w procentach) stanowi tzw.  stopień krzepliwości fibrynogenu [1].

Zewnątrzpochodny szlak krzepnięcia krwi

W zachodzącej w organizmie klasycznej kaskadzie krzepnięcia krwi, trombina może zostać aktywowana na drodze dwóch szlaków tj. szlaku zewnątrzpochodnego i wewnątrzpochodnego. Wspólnym celem dla obydwu dróg inicjacji krzepnięcia są osoczowe czynniki X i IX. W dalszych etapach procesu krzepnięcia, w obu przypadkach dochodzi również do aktywacji trombiny. Na wewnątrzpochodny tor krzepnięcia krwi składają się tzw. czynniki kontaktu, czyli białka do których zaliczane są osoczowe czynniki XI, XII, prekalikreinę osoczową oraz wielkocząsteczkowy kininogen(jednołańcuchowa glikoproteina) [8].

Krzepnięcie krwi in vivo

Proces ten zapoczątkowywany jest przez tromboplastynę tkankową (TF), która eksponowana jest na powierzchni komórek (zwłaszcza tych aktywowanych lub uszkodzonych komórek śródbłonka). TF zaliczana jest do glikoprotein śródbłonkowych, a w swojej budowie posiada miejsca wiążące fosfolipidy. Co więcej, białko to nie jest wykrywane w nieuszkodzonych komórkach śródbłonka, ale występuje w błonie komórkowej wielu innych typów komórek, które w normalnych warunkach nie mają kontaktu z krwią. W przypadku, gdy TF jest eksponowana na powierzchni aktywowanych lub uszkodzonych komórek śródbłonka lub gdy dochodzi do kontaktu krwi z komórkami tkanek pozanaczyniowych eksponujących TF na powierzchni, dochodzi do połączenia się TF  z czynnikiem VII. Następnie utworzony kompleks TF-VIIa na powierzchni pobudzonych komórek śródbłonka powoduje  aktywację czynników IX i X do IXa i Xa. Kompleks TF-VIIa i czynnik Xa na drodze sprzężenia zwrotnego dodatniego aktywuje jeszcze więcej czynnika VIIa. Z dostarczanych w trakcie badań danych wynika, że głównym zadaniem zewnątrzpochodnego szlaku krzepnięcia in vivo jest szybkie dostarczenie śladowych ilości trombiny, która następnie aktywuje czynniki XI, VIII i V. Ponadto związek ten powoduje agregację płytek krwi, łącznie wpływając na przyspieszanie procesu krzepnięcia krwi szlakiem wewnątrzpochodnym [9].

Oznaczanie stopnia krzepliwości fibrynogenu

Fibrynogen w roztworze przekształcany jest we włóknik pod wpływem działania trombiny. Ilość wykrzepionego włóknika do białka całkowitego znajdującego się w badanym preparacie stanowi o stopniu krzepliwości fibrynogenu. Parametr ten oznaczany jest w  procentach [1].

Wykonanie:

Do probówki w łaźni wodnej (w temp. 37°C) należy dodać 1 ml roztworu fibrynogenu (o stężeniu 0,1 -1%) wraz z dodatkiem 1 ml roztworu trombiny wołowej (8 j.NIH/ml w soli fizjologicznej). Tak przygotowany roztwór należy pozostawić na 1-godzinną inkubację,a  następnie utworzony w próbce włóknik nawinąć na szklaną bagietkę i odcisnąć na ściance probówki. Otrzymany skrzep przenieść na kawałek jedwabiu ułożonym na kilku warstwach bibuły filtracyjnej (o wymiarach 10x10 cm). Włóknik przemyć 3x za pomocą roztworu soli fizjologicznej (czynność tę wykonywać bardzo ostrożnie, najlepiej przemywając produkt za pomocą szklanej bagietki). Przemyty włóknik przenieść do probówki zawierającej 10 ml 40% roztworu mocznika w 0,2 M NaOH. Próbkę pozostawić na ok. 60 minut do całkowitego rozpuszczenia, a następnie roztwór zmierzyć spektrofotometrycznie przy długości fali równej λ= 280 nm (pomiar absorbancji w 1-centymetrowej warstwie roztworu wobec próby kontrolnej). Na podstawie otrzymanych wyników obliczyć stężenie wykrzepionego włóknika (współczynnik absorbancji Fg A ^1%₂₈₀= 15,5) oraz stopień krzepliwości fibrynogenu wg poniższego wzoru:

Stopień krzepliwości = stężenie fibrynogenu (mg/ml)x 10 ml / stężenie fibrynogenu (mg/ml) x 100% [1].

Uwaga: wysoki stopień krzepliwości fibrynogenu wskazuje na dużą czystość preparatu [1].

Pod wpływem działania trombiny i jonów wapnia fibrynogen znajdujący się w osoczu cytrynianowym ulega przekształceniu we włóknik stabilizowany lub niestabilizowany działaniem samej trombiny. By w próbce doszło do aktywacji czynnika XIII wymagana jest obecność obydwu czynników.

By sprawdzić zachowanie się włóknika w roztworach stabilizowanych i niestabilizowanych w niektórych roztworach można przeprowadzić poniższe doświadczenie.

Wykonanie:

Do przygotowanych w 2 szeregach 4 probówek znajdujących się w łaźni wodnej o temp. 37°C należy dodać:

- do pierwszego szeregu 1 ml 25 mM roztworu CaCl₂ (tj. 0,368 g CaCl₂∙2H₂O rozpuścić w pewnej ilości wody, a następnie uzupełnić do końcowej objętości równej 100 ml).

- do drugiego szeregu wprowadzić 1 ml 25 mM roztworu EDTA (tj. 0,93 g C₁₀H₁₄N₂O₈Na₂∙2H₂O rozpuścić w pewnej ilości wody, po czym uzupełnić do 100 ml).

Do wszystkich przygotowanych na statywach probówek należy wprowadzić po 1 ml osocza cytrynianowego wraz z 0,5 ml roztworu trombiny wołowej (20 j.NIH/ml w soli fizjologicznej). Zawartość probówek dokładnie wymieszać i inkubować przez 30 minut. Wytrącone w trakcie inkubacji skrzepy należy nawinąć na szklaną bagietkę i odcisnąć na ściance probówki  (otrzymane supernatanty usunąć), a włóknik przenieść ponownie do probówek.

Następnie do 2 pierwszych probówek z szeregu I i II odmierzyć po 5 ml roztworu mocznika (tj. 6 M roztwór mocznika otrzymany przez rozpuszczenie 36 g mocznika w ok. 90 ml wody i uzupełnienie próbki do objętości 100 ml). Do kolejnych dwóch probówek w szeregach dodać po 5 ml CH₂ClCOOH (1% roztwór), do kolejnych probówek po 5 ml 0,9% roztworu NaCl, a do ostatnich 2 probówek odmierzyć po 5 ml H₂O.

Otrzymane w powyższy sposób mieszaniny należy dokładnie wstrząsnąć (wszystkie probówki) i obserwować zachodzące zmiany tj. niestabilizowany włóknik powinien ulec rozpuszczeniu w 2 pierwszych roztworach  (probówka 1 i 2 z tego samego szeregu), zaś włóknik stabilizowany nie ulegnie rozpuszczeniu w żadnym z przygotowanych układów [1].