- Biochemia
- Biofizyka
- Biologia
- Biologia molekularna
- Biotechnologia
- Chemia
- Chemia analityczna
- Chemia nieorganiczna
- Chemia fizyczna
- Chemia organiczna
- Diagnostyka medyczna
- Ekologia
- Farmakologia
- Fizyka
- Inżynieria środowiskowa
- Medycyna
- Mikrobiologia
- Technologia chemiczna
- Zarządzanie projektami
- Badania kliniczne i przedkliniczne
Technika mikromacierzy DNA
Mikromacierze DNA są techniką pozwalającą na jednoczesną analizę wielu zmian w genach, jak również pozwalają badać poziom ekspresji dużych grup genów. Mikromacierze definiowane są jako zbiór fragmentów DNA, które w uporządkowany sposób związane są z odpowiednio zastosowanym podłożem (płytką szklaną lub plastikową). W większości stosowanych mikromacierzy wykorzystywane są sondy oligonukleotydowe, które są komplementarne do badanych sekwencji [2].
W zależności od przeznaczenia, budowę, sposób otrzymywania, a także ilość sond na jednej płytce, wyodrębniono dwa oddzielne systemy macierzy DNA:
- macierze oparte na oligonukleotydach (tzw. mikromacierze oligonukleotydowe o wysokiej gęstości). Ze względu na sposób ich otrzymywania zwany Genechip, wprowadzono określenie chipy DNA.
W mikromacierzach oligonukleotydowych wykorzystywana jest plastikowa płytka. Bezpośrednio na płytce (in situ) przeprowadzana jest reakcja kontrolowanej syntezy oligonukleotydów o określonej sekwencji. Otrzymane w ten sposób oligonukleotydy zazwyczaj mają długość mniejszą niż 30 bp, zbudowane są z 15–25 nukleotydów, a ich rozmiar nie przekracza 10 μm. Plastikowa płytka o powierzchni 2 cm2, będąca nośnikiem macierzy może zmieścić około 300 tys. sond oligonukleotydowych [2], [5].
- mikromacierze wysokiej gęstości, gdzie na powierzchni płytki znajduje się od kilkaset tysięcy do prawie 2 milionów sond [2].
- mikromacierze cDNA – w technice ich otrzymywania wykorzystuje się biblioteki klonów DNA, które są automatycznie nanoszone na szkiełko macierzy. Mikromacierze otrzymywane są na zwykłym szkiełku podstawowym preparatu mikroskopowego, na którym specjalna mikrodrukarka nanosi seryjnie odpowiednie sondy cDNA. Długość zastosowanych sond waha się w granicach 0,5–2kb. Same sondy uzyskuje się w wyniku klonowania produktów reakcji odwrotnego PCR (ang. RT-PCR). Możliwe jest naniesienie ok. 25 tys. fragmentów cDNA (sond DNA) na powierzchnię jednego szkiełka mikroskopowego pokrytego poli-L-lizyną, do której przyłącza się sondy cDNA [5].
Tego typu mikromacierze zostały opracowane na Uniwersytecie Stanforda, gdzie ze względu na kilka zalet wzbudziły ogromne zainteresowanie. Technika mikromacierzy cDNA pozwoliła na badanie ekspresji genów nawet w przypadku, gdy nie była znana ich pełna sekwencja, a wymogiem przeprowadzenia reakcji było dysponowanie odpowiednimi klonami DNA namnożonymi w wyniku reakcji odwrotnej transkrypcji i reakcję łańcuchową polimerazy z mRNA izolowanego z danych komórek [6].
Ciekawą alternatywą dla mikromacierzy „statycznych”, które zawierają sondy immobilizowane na szkiełku, są tzw. mikromacierze przepływowe znane również jako dynamiczne (ang. bead arrays, microfluidic system, flow-through technology). W przypadku tych mikromacierzy poszczególne sondy DNA zakotwiczone są na pływających swobodnie w roztworze ziarnach. Ziarna najczęściej są kuleczkami silikonowymi lub polistyrenowymi o średnicy kilku mm (od 24-30 mm) [9], [13].
Firma Luminex, w celu odróżnienia od siebie poszczególnych ziaren (tj. nośników specyficznych sekwencji oligonukleotydowych) do techniki wprowadziła unikatową mieszaniną dwóch barwników fluorescencyjnych (np. czerwonego i pomarańczowego zestawionych w odpowiedniej proporcji), którymi zostały wysycone ziarna. Trzeci zastosowany barwnik tzw. reporter (np. koloru zielonego) służy do znakowania badanej próbki biologicznej. Identyfikacja ziaren odbywa się z wykorzystaniem cytometrii przepływowej, gdzie przeprowadzany jest pomiar emisji barwników klasyfikacyjnych. W trakcie analizy przyjmuje się, że intensywność sygnału pochodzącego od barwnika reporterowego jest proporcjonalna do ilości sekwencji docelowej związanej z sondą [9], [13].
Tagi: mikromacierze, oligonukleotydy, sondy, otwrotna transkrypcja, PCR
wstecz Podziel się ze znajomymi
Recenzje