Barwienie proste drobnoustrojów

W barwieniu prostym wykorzystywany jest tylko jeden barwnik (np. błękit metylenowy lub fuksyna), którym traktuje się preparat przez ok. 1-2 minuty. Wśród metod barwienia znana jest metoda barwnikiem Giemsy, która pozwala na wybarwienie drobnoustrojów na różne kolory. I tak riketsje barwią się na czerwono, a krętki na fioletowo lub różowo. Barwnik Giemsy znalazł również zastosowanie w cytologii do barwienia do barwienia nukleoidu lub jąderka [2].

Barwienie złożone

W metodzie tej wykorzystywane jest kilka barwników według ściśle określonej kolejności (lub barwników występujących w mieszaninie). Przykładem barwienia złożonego jest barwienie metodą Grama, metodą Neissera i metodą Ziehl-Neelsena. Wśród znanych technik barwienia pojawia się również tzw. barwienie przeżyciowe, polegające na działaniu na nieutrwalony preparat żywych drobnoustrojów barwnikiem przygotowanym w dużym rozcieńczeniu, nie niszcząc tym samym komórek. Wybarwieniu ulegają komórki z uszkodzoną błoną komórkową, dzięki czemu zastosowany barwnik może swobodnie dostać się do jej wnętrza [2].

Barwienie metodą Grama

Metoda została wynaleziona w 1884 roku przez Christiana Grama. Oryginalny opis tej techniki barwienia pojawił się w tym samym roku w publikacji zatytuowanej: "The differential staining of Schizomycetes in tissue sections and in dried preparations" w Fortschitte der Medicin, Vol. 2. [6].

Gram dokonał swojego odkrycia podczas prób różnicowania komórek bakteryjnych z zakażonych tkanek. Pomimo, iż to właśnie Ch. Gram zaobserwował to, co obecnie nazywane jest „reakcją Grama”,nie dostrzegł taksonomicznej wartości tej techniki [3], [5], [6].

Metoda barwienia Grama wykorzystywana jest do różnicowania komórek nieuszkodzonych, morfologicznie podobnych bakterii na dwie grupy. Możliwe jest na podstawie oceny  koloru komórki po procesie jej  wybarwienia. Metoda pozwala również na  wyraźne różnicowanie komórek pod względem kształtu, rozmiaru oraz szczegółów strukturalnych. W oryginalnej procedurze barwienia  wykorzystywany jest nieorganiczny jod, który niestety szybko się utlenia i traci swoją skuteczność jako substancja trawiąca. Wraz z wdrożonymi modyfikacjami metody Grama, wprowadzono inny odczynnik tj. L-poliwinylopyrolidono-jod, który różni się od oryginalnego zestawu Grama tym, że jest bardziej stabilnym związkiem organicznym jodu  [3], [5], [6].

Podstawy teoretyczne barwienia  metodą Grama

1) Barwienie utrwalonego rozmazu za pomocą fioletu krystalicznego, zastosowanie jodu jako substancji trawiącej [3].

2) Odbarwienie pierwszego barwnika za pomocą alkoholu lub acetonu, a następnie zastosowanie barwnika kontrastowego (safraniny lub zasadowej fuksyny).

3) Kompleks fiolet krystaliczny-jod tworzy się w protoplaście (część komórki bez ściany komórkowej) wszystkich organizmów barwionych za pomocą metody Grama. Organizmy, które są zdolne zachować kompleks barwiący po odbarwieniu klasyfikowane są jako gram-dodatnie, z kolei te, które można odbarwić i zabarwić kontrastowo, zaliczane są do organizmów gram-ujemnych [3]. Kompleks fiolet krystaliczny-jod jest nierozpuszczalny w wodzie i słabo rozpuszczalny w alkoholu oraz acetonie [9].

4) Po pęknięciu (lub usunięciu) ściany komórkowej protoplast komórek gram-dodatnich i gram-ujemnych można odbarwić. Powoduje to  utratę cechy gram-dodatniej. Nienaruszona ściana komórkowa działa jak bariera chroniąca przed odbarwieniem pierwszego barwnika [3].

5) Ściana komórkowa jest przepuszczalna w sposób nieselektywny. Podczas procedury barwienia metodą Grama ściana komórkowa komórek gram-dodatnich ulega odwodnieniu przez alkohol zawarty w odbarwiaczu i traci przepuszczalność, zatrzymując pierwotny barwnik. Ściana komórkowa komórek gram-ujemnych charakteryzuje się większą zawartością lipidów, przez co też staje się bardziej przepuszczalna podczas traktowania komórek alkoholem, co z kolei powoduje utratę pierwszego barwnika [3].