Wykonanie:

W metodzie tej utrwalony podwyższoną temperaturą rozmaz należy zalać roztworem fuksyny karbolowej, po czym podgrzewać szkiełko podstawowe do momentu, gdy roztwór zacznie parować (nie powinien się gotować). Szkiełko należy utrzymywać w temperaturze bliskiej wrzenia przez około 5 minut, następnie schłodzić go w powietrzu, po czym spłukać pod bieżącą wodą. W kolejnym etapie przeprowadza się odbarwianie preparatu poprzez zanurzanie szkiełka podstawowego w mieszanie kwasu i alkoholu (np. 3% stężonego kwasu solnego w 90% etanolu), za każdym razem zmieniając roztwór na świeży. Po opłukaniu szkiełka wodą rozmaz należy barwić kontrastowym barwnikiem, np. zielenią malachitową,po czym  ponownie spłukuje się go wodą i suszy. Bakterie wykazujące cechę kwasooporności wybarwiają się na czerwono,a  pozostałe na kolor zielony [1],[2].

Zdjęcie: Etapy barwienia metodą Ziehl-Neelsena, http://www.biotechinfo.in/study-material-/acid-fast-staining-by-ziehl-neelsen-method/

Barwienie negatywowe

Metoda ta wykorzystywana jest do uwidaczniania obecności otoczek bakteryjnych.  Komórki  pobrane z hodowli bakteryjnej miesza się na szkiełku podstawowymnp. z roztworem nigrozyny naniesionym oczkiem ezy. Preparat  przykrywa sięszkiełkiem nakrywkowym i ogląda w mikroskopie z obiektywem immersyjnym (lubzwykłym) o dużym powiększeniu, np. 40-krotnym. Otoczka bakteryjna widoczna jest jako przejrzysta, jasna strefa między komórką a jej ciemnym tłem [1].

Wykonanie:

1) Na utrwalony preparat należy nanieść: roztwór fuksyny z kilkoma kroplami fuksyny zasadowej. Szkiełko ułożyć na statywie do barwienia, a następnie  podgrzać je od spodu płomieniem palnika (do momentu ukazania się pary)

2) po ostudzeniu, preparat należy spłukać wodą i osuszyć na bibule

3) na brzeg szkiełka nanieść kroplę nigrozyny lub kolargolu i rozciągnąć barwnik równomiernie po powierzchni rozmazu (wykorzystać  w tym celu krawędź drugiego szkiełka podstawowego)

4) otrzymany preparat wysuszyć w powietrzu

W wyniku barwienia komórka bakteryjna barwi się na kolor różowy,a  tło na kolor szary (nigrozyna) lub żółtobrązowy (kolargol). Otoczka komórki pozostaje bezbarwna [13].

W metodzie tej mogą być wykorzystywane różne barwniki. Najczęściej do zabarwienia komórek bakteryjnych stosuje się fuksynę z dodatkiem fuksyny karbolowej, zaś w zabarwieniu tła wykorzystywana jest np. nigrozyna lub kolargol [13].

Autor: Lidia Koperwas

Literatura:

[1]. Singleton P., 2000. Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie. Wydawnictwo Naukowe PWN. S.  366-368

[2]. Różalski A., 2003. Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej. Skrypt dla studentów biologii. Wydanie III. Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, 2003. Częśc I-teoretyczna. s. 34-39.

[3]. http://www.bd.com/resource.aspx?idx=19569

[4]. http://faculty.cbu.ca/cglogowski/2008%20BIOL101LAB2.htm

[5]. http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=1

[6]. Rao S.PN., Gram’s staining. http://www.microrao.com/micronotes/pg/Gram%20stain.pdf
[7]. Acharya T., 2013. Ziehl-Neelsen technique: Principle, Procedure and reporting. Online Medical Microbiology guide. http://microbeonline.com/ziehl-neelsen-technique-principle-procedure-reporting/
[8]. http://www.biotechinfo.in/study-material-/acid-fast-staining-by-ziehl-neelsen-method/

[9].   Schlegel H.G., 2003. Mikrobiologia ogólna. Wydawnictwo Naukowe PWN, s. 71-72.

[10]. http://www.biomerieux.pl/upload/Aktualno%C5%9Bci_64_ok.pdf

[11]. Skóra J., Szponar B., Paściak M., Gutarowska B., 2013. Identyfikacja aktynobakterii środowiskowych stanowiących potencjalne zagrożenie zawodowe. Postepy Hig Med Dosw. (online), 2013; 67: 1222-1234. http://www.phmd.pl/fulltxthtml.php?ICID=1079001

[12]. Hussey M.A., Zayaitz A., 2008. Acid-Fast Stain Protocols. http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/2870-acid-fast-stain-protocols

[13]. http://bg.umed.lodz.pl/images/wydawnictwa/skrypty/mikrobiologia_analityka.pdf

[14]. http://pulmonologia.mp.pl/choroby/68756,gruzlica-i-mykobakteriozy

[15]. https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=22836

[16]. http://tbcindia.nic.in/pdfs/Training%20manual%20M%20tuberculosis%20C%20DST.pdf

[17]. http://textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html