- Biochemia
- Biofizyka
- Biologia
- Biologia molekularna
- Biotechnologia
- Chemia
- Chemia analityczna
- Chemia nieorganiczna
- Chemia fizyczna
- Chemia organiczna
- Diagnostyka medyczna
- Ekologia
- Farmakologia
- Fizyka
- Inżynieria środowiskowa
- Medycyna
- Mikrobiologia
- Technologia chemiczna
- Zarządzanie projektami
- Badania kliniczne i przedkliniczne
Białko cystatyny C jako marker filtracji kłębuszkowej
Przygotowanie próbek:
Próba ślepa (blank), standard, próba badana: należy je przygotować na osobnej 96-dołkowej płytce do testu ELISA, a następnie równocześnie przenieść na płytkę, na której wykonywane będzie oznaczenie.
Procedura badania:
- Przygotowanie standardowych rozcieńczeń próbek (wg poniższej tabeli):
- Przygotowanie studzeniek z próbą ślepą (blankiem): do studzienek dodać jedynie roztwory chromogenu A i B, a następnie zatrzymać reakcje podczas standardowych etapów procedury
- Przygotowanie studzienek ze standardem: dodać 50 µl standardu i 50µl streptawidyny-HRP (przeciwciała znakowane biotyną zostały dodane wczesniej do standardu)
- Przygotowanie studzienek z próbką badaną: 10 µl próbki rozcieńczyć 30 µl roztworu do rozcieńczeń (1% BSAw PBS, pH=7,4), następnie dodać 10 µl przeciwciał wyznakowanych biotyną anty-cystatyna C oraz 50µl strepawidyną-HRP. Próbkę dokładnie wymieszać, nie wirować.
- Wszystkie otrzymane roztwory przenieść na płytkę ELISA. Płytkę umieścić w foliowej torebce, delikatnie mieszać przez 60 minut w 37⁰C.
- Przygotować roztwór do przemywania: 30x stężony roztwór do przemywania należy doprowadzić do stężenai 1x za pomocą wody. Przygotować 600 µl 1x roztworu na każdą studzienkę.
- Przemywanie płytki: delikatnie usnąć membranę (folię) zabezpieczającą płytke przed wysychaniem oraz zanieczyszczeniem. Ze studzienek usunąć płyn, a następnie do każdej z nich dodać 100 µl roztworu do płukania. Usunąć płyn po 30 sekundach. Następnie powtórzyć procedurę przemywania jeszcze 5 razy. Osuszyć płytkę.
- Utrwalanie koloru: do każdej studzienki dodać 50 µl chromogenu A, a następnie 50 µl chromogenu B. Delikatnie wymieszać roztwory A i B, inkubować płytke (chroniąc ją przed światłem) przez 10 minut w 37⁰C.
- Zatrzymywanie reakcji: do każdej studzienki dodać 50 µl roztworu Stop I (w wyniku zatrzymania reakcji zachodzi zmiana koloru roztworu z niebieskiego na żółty).
- Odczytanie wyników: w przeciągu 10 minut od dodania do próbek roztworu stopującego reakcję należy wykonać pomiar absorbancji przydługości fali równej 450 nm. Studzienka z próbką ślepą (blank) stanowi pomiar zerowy, absorbancję (OD) należy zmierzyć dla każdego dołka płytki [15].
Analiza danych: w tym celu należy sporządzić krzywą wzorcową, z której odczytuje się wyniki stężeń.
Zdj. Uproszczony schemat powyższej procedury oznaczanai stężenia ludzkiej cystatyny C (ELISA Kit), [15].
Tagi: cystatyna C, Cys-C, ocena funkcji nerek, inhibitory proteinaz cysteinowych, marker wydolności nerek
wstecz Podziel się ze znajomymi
Recenzje