2) Barwienie powierzchniowe (przeciwciała sprzężone z barwnikami fluorescencyjnymi): przeprowadzane jest bezpośrednio po uzyskaniu zawiesiny materiału, który poddaje się inkubacji z przeciwciałem monoklonalnym bądź też z wieloma przeciwciałami, które sprzężone są z różnymi fluorochromami. Wymagane jest by barwienie przeprowadzać w ciemności i w temperaturze pokojowej. Wybarwione komórki poddawane są działaniu buforu, którego zadaniem jest utrwalenie barwienia. Bufor ten dodatkowo powoduje lizę erytrocytów, co jest niezbędne do analizy próbek z krwi i szpiku kostnego. W zależności od zastosowanej mody barwienia, po etapie lizy może pojawić się etap przepłukania komórek buforem (najczęściej zawierającym PBS), co ma na celu usunięcie niezwiązanych przeciwciał i resztek roztworu lizującego [17].

3) Barwienie wewnątrzkomórkowe z wykorzystaniem przeciwciał: w barwieniu antygenów wewnątrzkomórkowych (cytoplazmatycznych i jądrowych) wymagane jest wcześniejsze utrwalenie komórek. Utrwalanie zazwyczaj wykonywane jest poprzez inkubację w roztworze z formaldehydem. Następnie po utrwaleniu, komórki zostają poddane permeabilizacji łagodnym detergentem. W wyniku tego procesu dochodzi do częściowej dezintegracji błony komórkowej, która staje się przepuszczalna dla cząstek określonych rozmiarów. Równocześnie z działaniem środka permeabilizującego, komórki poddaje się inkubacji z przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko wewnątrzkomórkowemu antygenowi. Właściwie dobrany środek permeabilizujący pozwala na przejście do wnętrza komórki dużych cząsteczek np. przeciwciał klasy IgM. Roztwór utrwalający, permeabilizujący oraz niezwiązane przeciwciała należy opłukać z wykorzystaniem roztworu PBS [17].

Autor: Zuzanna Koperwas

Literatura:

[1]. Gołąb J., Nowoczesna diagnostyka medyczna i biosensory w medycynie. http://info.ifpan.edu.pl/nanobiom/ichf/JG2.pdf

[2]. Powroźnik B., Kubowicz P., Pękala E., 2012. Monoclonal antibodies in targeted therapy.

 Postepy Hig Med Dosw (online), 2012; 66: 663-673.

[3]. Chames P., Baty D., 2009. Bispecific antibodies for cancer therapy. Journal List, MAbs, v.1(6); Nov-Dec 2009. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2791310/

[4]. Szwed M., Marczak A., Rogalska A., Matusiak A., Jóźwiak Z., 2010. Rola przeciwciał monoklonalnych w transporcie leków do komórek nowotworowych. Nowotwory Journal of Oncology 2010, volume 60, Number 5, 442-450.

[5]. Greenfield E.A., 2014. Generating monoclonal Antibodies. http://www.cshlpress.com/pdf/sample/2013/Antibodies2/AB2Intro7Part1.pdf

[6]. http://www.microrao.com/micronotes/mcab.pdf

[7]. Jakóbisiak M., Przeciwciała monoklonalne, Immunologia, red. Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W., wydaw. PWN, 2005, s. 45-53.

[8].http://biotechnologia.pl/farmacja/artykuly/przeciwciala-nowoczesne-narzedzia-wspolczesnej-medycyny,11014

[9]. Ansar W., Ghosh S., 2013. Monoclonal Antibodies: A Tool in Clinical Research, 

 Indian Journal of Clinical Medicine 2013:4 9–21.

[10]. Zieliński M., Płuciemmiczak A., 2009. Przeciwciała monoklonalne- zastosowanie w medycynie. Biotechnologia 2 (85), 113-122, 2009. http://www.pfb.info.pl/files/kwartalnik/2_2009/08.%20Zielinski.pdf

[11]. Pandey S., 2010. HYBRIDOMA TECHNOLOGY FOR PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES. Volume 1, Issue 2, March –April 2010; Article 017. http://www.globalresearchonline.net/volume1issue2/Article%20017.pdf

[12]. Jaszczołt M., Boczkaj G., Grygoryshyn K., Kamiński M., 2011. Immunochromatografia: przegląd i charakterystyka immunosorbentów oraz metod immobilizacji. CAMERA SEPARATORIA previously POSTĘPY CHROMATOGRAFII , Volume 3, Number 1 / June 2011, 69-85. http://dach.ich.uph.edu.pl/cs/download/cs_vol3_no1/_cs_2011_69-85.pdf

[13]. Sosińska-Mielcarek K., Jassem J., 2005. Przeciwciała monoklonalne w leczeniu nowotworów litych. Onkologia w praktyce klinicznej, tom1, nr 4. https://journals.viamedica.pl/oncology_in_clinical_practice/article/viewFile/9396/8012

[14]. http://www.cancer.org/acs/groups/cid/documents/webcontent/003013-pdf.pdf

[15]. Gołąb J., Nowoczesna diagnostyka medyczna oraz biosensory w medycynie. http://info.ifpan.edu.pl/nanobiom/ichf/JG2.pdf

[16]. Cichoń D., Podstawy immunochemii i przykłady jej zastosowania w diagnostyce medycznej, http://bioinfo.mol.uj.edu.pl/articles/Cichon03

[17]. Sędek Ł., Mazur B., 2008. Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne i ich zastosowanie w cytometrii przepływowej. Postępy Biologii Komórki, Tom 35, 2008, Suplement Nr 24 (17-34). http://www.pbkom.eu/sites/default/files/artykulydo2012/35_s24_17.pdf

[18]. Rosiński M., Piasecka-Kwiatkowska D., Warchalewski J.R., 2005. Przegląd metod separacji i oczyszczania białek przydatnych w badaniach i analizie żywności. ŻYWNOŚĆ. Nauka.Technologia.Jakość, 2005, 3 (44), 5-22. http://www.pttz.org/zyw/wyd/czas/2005,%203%2844%29/01_Rosinski.pdf

[19].http://www.ptglab.com/Support/TechnicalSupport/LearningCenter/AntibodyProductionAndPurification.aspx

[20]. http://neobiolab.com/research/monoclonal-versus-polyclonal-antibodies

[21]. Leenaars M., Hendriksen C.F.M., 2005. Critical Steps in the Production of Polyclonal and Monoclonal Antibodies: Evaluation and Recommendations.  ILAR Journal, Volume 46, Issue 3 Pp. 269-279. http://ilarjournal.oxfordjournals.org/content/46/3/269.full